基于代谢组学探讨扶正祛瘀通下法治疗脓毒症大鼠心肌损伤作用机制

潘振亚 赵 娜 马晨瑜 祝韵薇 邓 旻

脓毒症是由于宿主对感染的反应失调而产生威胁生命的器官功能障碍[1]，是临床常见危重症，极易导致患者死亡。研究表明，当机体发生脓毒症时，肠道菌群多样性及丰度发生显著变化，而菌群的代谢产物与心肌能量代谢、线粒体功能及炎症反应存在密切相关性[2-3]。前期研究发现，扶正祛瘀通下法可改善脓毒症大鼠肝、肾等脏器功能，并且可以有效保护肠道屏障功能[4-5]。本研究继续以参附桃红承气汤为方，基于代谢组学探讨扶正祛瘀通下法对脓毒症大鼠心肌损伤的保护机制。现报道如下。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF 级Wistar 雌、雄大鼠各15 只，体质量（200±20）g，由浙江中医药大学动物实验研究中心提供，动物生产许可证号：SCXK（沪）2018-0006，动物实验许可证号：SYXK（浙）2018-0012。大鼠自由饮水，饲养环境温度（21±2）℃，湿度（55±5）%。本研究经浙江中医药大学实验动物管理与伦理委员会审核，批准编号：20190805-07。

1.2 实验试剂与仪器 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，购自美国Sigma 公司，批号L2880），H-7650 透射电子显微镜（日本日立公司），小动物超声系统（Fuji film 公司vevo1100 系统），超高效液相色谱仪（美国Waters 公司，型号：ACQUITY UPLC）、质谱仪（美国AB SCIEX 公司，型号：TOF-5600）、NewClassic MS 电子天平（瑞士METTLER TOLEDO 公司，型号：NewClassic MF MS105DU）、冷冻离心机（德国Eppendorf 公司，型号：Centrifuge 5424 R）。

1.3 实验药物 太子参20g，制附子、红花、桃仁、芒硝、生大黄、桂枝、厚朴、枳实、甘草各10g，由杭州市红十字会医院药剂科提供，浓煎至8g/mL，过滤除菌分装，4℃保存。

2 实验方法

2.1 分组与造模 30 只Wistar 大鼠采用随机数字表法分为模型组、实验组、空白对照组，每组10 只。模型组及实验组大鼠在麻醉后采用单次腹腔注射脂多糖10mg/kg 方法建立大鼠脓毒症模型。空白对照组给予单次腹腔注射生理盐水。若大鼠在给药6h 后出现精神萎靡、活动减少、刺激反应减弱等现象，证明造模成功。

2.2 给药方法 从造模前3 天开始给药，实验组给予中药1mL 灌胃，生药剂量为8g/只，2 次/天；模型组予以生理盐水1mL 灌胃，2 次/天；空白对照组给予生理盐水1mL 灌胃，2 次/天；至大鼠造模后12h，检测各组大鼠心功能后处死大鼠。

2.3 标本采集与检测

2.3.1 心脏超声评估心功能 各组大鼠经10%水合氯醛腹腔麻醉后通过小动物超声仪取左室乳头肌水平短轴切面，检测大鼠左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF），取3个心动周期的平均值记录数据。

2.3.2 心肌细胞超微结构观察 各组大鼠在处死后迅速打开胸腔摘取心脏，取左心室约5mm 厚心肌组织，使用4%戊二醛灌注固定24h，再用PBS 溶液洗涤3 次，在1%锇酸中固定3h，梯度经乙醇和无水丙酮脱水、氧化丙烯置换、环氧树脂包埋，经染色后使用透射电子显微镜观察心肌细胞超微结构并拍照。

2.3.3 液相色谱-质谱联用（liquid chromatographymass spectrometry，LC-MS）分析 在距盲肠2cm 前剪开肠管，取粪便在-80℃下冻存，用时取待检测粪便样本50mg 置于EP 管中，加入400μL 80%的甲醇水溶液，涡旋振荡，于-20℃环境中静置30min，离心（13000r/min、4℃）15min，取上清液进行LC-MS 分析。（1）色谱条件：色谱柱为BEHC18 柱（100mm×2.1mm i.d.，1.7μm；Waters，Milford，USA）；流动相A为水（含0.1%甲酸），流动相B 为乙腈/异丙醇（1/1）（含0.1%甲酸）；梯度洗脱程序为0～3min：0～20%B，3～9min：20%～60%B，9～11min：60%～100%B，100%B维持2.5min，13.5～13.6min：100%～0%B，0%B 维持2.4min。流速为0.40mL/min，进样量为20μL，柱温为40℃。（2）质谱条件：样品质谱信号采集分别采用正负离子扫描模式，电喷雾毛细管电压，进样电压和碰撞电压分别为1.0kV、40.0V和6.0eV。离子源温度和去溶剂温度分别为120℃和500℃，载气流量900L/h，质谱扫描范围50～1000m/z，分辨率为30000。（3）数据采集及分析：将LC-MS 获得的质谱原始数据导入代谢组学处理软件Progenesis QI（Waters Corporation，Milford，USA）进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐等预处理，得到的数据矩阵进行归一化处理后采用SIMCA-P+14.0 软件（Umetrics）进行主成分分析（principal component analysis，PCA）、有监督偏最小二乘法判别分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）和正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）等多维统计分析。采用PLS-DA 模型第一主成分的变量投影重要度（VIP）值、差异倍数（FC）、并结合T-test 的P 值进行差异代谢物的筛选，并利用Metabo Analyst 网站对鉴定出的差异代谢物进行代谢通路分析。

2.4 统计学方法 应用SPSS 24.0 软件对数据进行统计分析，实验数据用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t 检验，P<0.05 认为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组大鼠LVEF 值比较与空白对照组比较，模型组及实验组大鼠LVEF 值均下降（P＜0.05）；与模型组比较，实验组大鼠LVEF 值显著升高（P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠LVEF 值比较（%，±s）

表1 各组大鼠LVEF 值比较（%，±s）

注：空白对照组及模型组给予1mL/次生理盐水灌胃，2 次/天；实验组给予1mL/次参附桃红承气汤灌胃，2 次/天；LVEF 为左心室射血分数；与空白对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

3.2 各组大鼠电镜下心肌超微结构 空白对照组大鼠心肌细胞线粒体结构完整，脊线完好无损，未见明显肿胀、空泡化等情况；实验组出现少量线粒体损伤及脊线断裂，而模型组有大量的线粒体肿胀、坏死，并且出现脊断裂及空泡化。见图1。

图1 各组大鼠电镜下心肌超微结构（×15000）

3.3 各组大鼠代谢组学分析情况

3.3.1 PCA 分析 利用PCA 进行各组大鼠肠道代谢物之间的差异性分析，可见各组大鼠代谢物正、负离子模式下均产生了明显分离。见图2。

图2 阳离子（A、C）和阴离子（B、D）模式下各组大鼠代谢PCA 图

3.3.2 PLS-DA 分析 进一步对模型组和实验组大鼠进行PLS-DA 分析，在正、负离子模式下，模型组与实验组均出现明显分离，组内聚合度较高，结果与PCA 分析基本一致。见图3。

图3 阳离子（A）和阴离子（B）模式下模型组和实验组大鼠代谢PLS-DA 图

3.3.3 差异代谢物筛选及代谢通路分析 以OPLSDA 模式判别中的VIP>1 以及P＜0.05 为条件，进行差异代谢物筛选，共筛选出81个差异代谢物，其中正离子模式下52个，负离子模式下29个，通过火山图可以看出距离中心越远的点越可能成为差异代谢物（见图4）。最终共鉴定出9个对分类贡献较大的代谢物作为脓毒症心肌损伤后相关的差异代谢物。使用Metaboanalys 软件对9个差异代谢产物进行代谢通路的富集分析，共获得了6 条代谢通路。见表2、图5。

图5 差异代谢物代谢通路分析

表2 各差异代谢物信息表

图4 差异代谢物火山图

4 讨论

本研究代谢组学分析结果显示，与模型组比较，经中药干预后的实验组上调苯甲酸盐代谢、黄酮类生物合成及酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸代谢，下调类固醇激素生物合成等代谢通路。

黄酮类化合物具有抗氧化和清除自由基、抗炎、抗菌和改善微循环等作用[6]。山奈酚可以促进缺氧心肌细胞增殖、抑制缺氧心肌细胞凋亡、降低活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）水平和抑制自噬[7]；芹菜素可通过对环氧化酶-2（COX-2）和核转录因子-κB（NF-κB）活性的抑制而减少促炎性细胞因子的产生，并且可抑制自由基的过氧化反应，激活组织中氧化酶的活性来发挥抗心肌缺血作用[8]；芦荟苷通过激活蛋白激酶B（AKT）/内皮型一氧化氮（eNOS）信号通路抑制心肌细胞氧化应激及凋亡，从而改善缺血再灌注大鼠心肌损伤[9]。柚皮素是柚皮甙的甙元，属二氢黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤和心肌保护活性[10]。柚皮素可抑制炎症相关因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）等表达水平，并且通过促凋亡蛋白因子Bax降低、抗凋亡蛋白因子Bcl-2 增加等途径来减轻心肌细胞的炎症与凋亡[11]。参附桃红承气汤可能通过抗氧化、抑制心肌细胞凋亡等途径减轻脓毒症大鼠心肌损伤。

色氨酸是人体必需氨基酸之一，可参与体内血浆蛋白质的更新。色氨酸最终可以通过5 羟色胺（5-HT）与犬尿氨酸（kyn）两条途径进行分解代谢，5 羟基吲哚乙酸是5-HT 代谢途径的产物[12]。研究表明，5-HT 可与血管平滑肌细胞的细胞膜相应受体结合，激活磷脂酶后产生的三磷酸肌醇与受体再结合，Ca2+内流通道激活，使血管收缩、升高血压。另有研究表明，5-HT通过介导5-羟色胺受体4（5-HTR4）使心肌收缩力增强，从而达到正性肌力的效果[13-14]；酪氨酸是人体的条件必需氨基酸和生酮生糖氨基酸，经酪氨酸脱羧酶的催化可转成酪胺，再进一步代谢可生成N-甲基酪胺。N-甲基酪胺可增加冠脉血流量和肾血流量，降低心肌耗氧量，具有显著的抗休克效果；异亮氨酸是人体必需氨基酸之一，是最有效的一种支链氨基酸，亮氨酸协同缬氨酸修复肌肉，控制血糖，并为身体组织提供能量。据研究表明，异亮氨酸可刺激哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）磷酸化，可显著正调控mTOR通路[15]。参附桃红承气汤可能通过调节色氨酸、酪氨酸、异亮氨酸等氨基酸代谢来缓解脓毒症大鼠心肌损伤。

灵芝酸是一种三萜类物质，可抑制IL-1β、IL-6和TNF-α 等炎症因子的表达，同时可抑制氧化应激及抑制Toll 样受体（TLRs）/NF-κB信号通路和凋亡信号通路相关蛋白表达，从而达到减轻大鼠心肌损伤的效果[16]。

7-脱氢胆固醇由胆固醇转化而来，属于固醇类物质。高胆固醇血症是缺血性心脏病发生发展的重要危险因素。与模型组相比，实验组大鼠肠道代谢产物中7-脱氢胆固醇显著减少，说明参附桃红承气汤可能通过调整脂质代谢来改善心肌损伤情况。

综上所述，扶正祛瘀通下法（参附桃红承气汤）改善脓毒症大鼠心肌损伤的主要代谢通路包括黄酮类的合成、氨基酸代谢、苯丙酸代谢、类固醇激素生物合成等途径。