基于数据挖掘和网络药理学研究原发性骨肿瘤的用药规律及作用机制

严卿莹 刘云霞 姚勇伟 王翌庆 杨洁文 徐叶峰

原发性骨肿瘤是发生于骨骼或其附属组织的肿瘤，包括骨肉瘤、软骨肉瘤及尤文肉瘤，具有恶性程度高、易致残等特点，严重威胁儿童及青少年的健康。尽管骨肿瘤在所有癌症中的所占比例不足0.2%，但在过去十年中，其发病率以每年0.3%的速度增长[1]。我国人口基数庞大，据研究统计，2014 年我国约有24，000例新确诊病例和17，200例死亡病例，发病率为1.32/100，000[2]。不同类型的骨肿瘤治疗方式略有差异，其共同目标均为提高生活质量，延长生存期[3]。新辅助化疗、辅助化疗结合手术是治疗骨肿瘤的首选，然而肿瘤的耐药、复发转移，是导致患者死亡的主要原因。

中医药治疗肿瘤，有增效减毒之功效。然而中药成分复杂，作用靶点较多，抗肿瘤机制尚未明确，在临床运用中仍存在一定局限性。因此，本文通过收集中医药治疗原发性骨肿瘤的文献，应用现代信息技术挖掘中医药临床治疗骨肿瘤的用药规律及潜在药物组合，并通过构建成分-靶点网络图，探究中医药治疗骨肿瘤潜在的作用机制，报道如下。

1 资料与方法

1.1 检索方法 以“中医”“中医药”“中药”“中西结合”“中西医”“骨肉瘤”“骨肿瘤”“骨恶性肿 瘤”“尤 文肉瘤”为主题词，检索中国知网（CNKI）、万方数据知识服务平台、维普网1979 年1 月—2020 年2 月收录的文献。

1.2 纳入及排除标准 纳入标准：采用有明确药物组成的中药或成药组方治疗骨肿瘤的临床研究、病例报告研究。排除标准：（1）动物及细胞实验研究；（2）纯理论类文献；（3）组方不明的中药及中成药治疗骨肿瘤的研究；（4）针灸及外用中药治疗骨肿瘤的研究；（5）治疗对象为转移性骨肿瘤的研究。

1.3 药物统计 文献中方剂组成药物及其加减药物均予统计，若为病例报道，则取首次就诊资料进行统计。中药名称及性味归经参照《中华本草》[4]及“十二五”全国高等中医药院校规划教材《中药学》[5]，如将生地转化为生地黄，熟地转化为熟地黄，米仁转化为薏苡仁，旱莲草转化为墨旱莲，旋复花转化为旋覆花，元参转化为玄参，银花藤转化为忍冬藤，鹿含草转化为鹿衔草等。

1.4 聚类统计 使用Excel 2016 软件建立数据库，将文献编号，提取药物名称，性味归经等数据，将处方涉及到的药物进行二值量化，如果出现则录为“1”，否则录为“0”，运用IBM SPSS Statistics 24.0 进行聚类分析，通过SPSS Modeler 18.0 分析高频药物之间的关联度，设置“类型”和“设为标志”两个节点进行中药网络化展示，并创建Apriori 模型，对药物进行关联规则分析。

1.5 高频药物预测靶点 在TCMSP 数据库中查找最高频药物的分子信息，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30，药物半衰期（half-life，HL）≥4h，类药性（drug likeness，DL）≥0.18 为条件，筛选活性成分，取分子结构图或典型smiles 结构，上传至ChemMapper（http://lilab.ecust.edu.cn/chemmapper/）数据库，并设定3D 相似性>0.85，预测活性成分的可能作用靶点。

1.6 骨肿瘤的预测靶点 于DisGENT 数据库（https://www.disgenet.org）及TTD 数据库（http://db.idrblab.net/ttd/）中，以“Bone sarcoma”“Malignant bone neoplasm”“Osteosarcoma”等关键词检索骨肿瘤的潜在靶点，删除重复靶点，设定得分>0.04 的目标靶点作为骨肿瘤的潜在靶点。

1.7 网络的构建与信号通路分析 使用Cytoscape 3.2.1 软件构建成分-靶点网络，并通过其插件CentiScape 分析网络以计算拓扑参数，以自由度、介数等参数验证成分及靶点的重要性，将黄芪治疗骨肿瘤的相关靶点导入ClueGO 插件进行分析，设定P≤0.01，以Reactome pathways 富集通路分析高频药物治疗骨肿瘤的可能机制。

2 结果

2.1 药物使用频次分析 本研究纳入29 篇文献，共30 张处方，统计药味145 味药，总频次436 次。其中黄芪用药频次最高，共19 次，单味用药次数/总体用药次数（频率1）为4.36%，单味药用药次数/处方数（频率2）为63.33%，使用频次较高的前10 味中药依次为黄芪、甘草、白术、当归、熟地黄、茯苓、山药、补骨脂、党参、牡丹皮，见表1。

表1 骨肿瘤高频药物使用情况

2.2 药物类别频数分析 将145 味中药进行分类，主要有补虚药、清热药、活血化瘀药、化痰止咳平喘药、利水渗湿药、解表药、祛风湿药、平肝熄风药、理气药、消食药、化湿药、止血药、温里药、收涩药、安神药、攻毒杀虫止痒药、泻下药共17 大类。累积频率最高为补虚药，共30 次，频率（该药物类别用药频次/总药物类别有效数据）为20.69%，其次为清热药及活血化瘀药。见表2。

表2 药物类别使用情况

2.3 药物性味频数分析 将所有药物进行药性和药味频数分析，其中药味使用频次最高者为甘味药物，共71 次，占药性总数比例为29.71%（该药味用药频次/药味有效数据总数）；药性使用频次最高者为温药，共43 次，占药性总数比例为29.66%（该药性用药次数/药性有效数据总数）。见表3。

表3 不同性味药物使用频率

2.4 药物归经分析 对所有药物的归经进行频数分析，发现归经频数最高的是肝经，共87 次，占归经总数比例为24.44%（该经的频数/总归经有效频数），其次为肾经、脾经、胃经。见表4。

表4 不同归经药物使用频率

2.5 高频药物聚类分析 对高频药物（频数≥5）进行系统聚类分析，共得到三类。类一，共包含牛膝、桑枝、斑蝥、骨碎补、菊花、鹿角胶、山楂、山茱萸、泽泻、牡丹皮、山药、熟地黄、补骨脂、杜仲14 味药，以补肾填精为主；类二，包含夏枯草、半夏、竹茹、薏苡仁4味药，以化痰利湿散结为主；类三，包含白芍、白术、当归、党参、黄芪、甘草、茯苓7 味药，以补益气血为主。见图1。

图1 用药聚类分析树状图

2.6 高频药物关联规则分析 对高频药物（频数≥5），使用SPSS Modeler 18.0 软件进行关联规则分析，对高频药物进行中药网络化展示（见图2），其中线条粗细程度表示两种药物之间的关联度的强弱。利用Apriori 建模挖掘药物之间的配伍关系，设置最小支持度为25%，最小置信度为90%，最大前项数为5，提升度＞1，共挖掘核心药对六组，见表5。

表5 高频药物关联规则分析

图2 高频药物治疗骨肿瘤的关联网络图

2.7 成分-靶点网络分析 TCMSP 中共包含87个黄芪的主要成分，根据活性成分筛选条件，可得到16个主要成分，其预测靶点情况见表6。对16个活性成分及其预测靶点进行成分-靶点网络的构建，其中有51个节点，包括16个成分节点和35个预测靶点（见图3），其中成分节点以菱形显示，预测靶点以椭圆形节点显示，节点颜色根据自由度（degree）由大到小从橙红色到黄色显示。结果显示，桦木酸自由度为17，介数为0.19066，为黄芪治疗骨肿瘤中发挥的主要成分（见表7），而GSK-3β 为16个成分的共有靶点，因此我们认为GSK-3β 是黄芪治疗骨肿瘤的最主要靶点，ESR1、PPARG、PTGS2 亦为重要靶点，见表8。

表7 黄芪各成分的自由度及介数

表8 主要靶点的自由度及介数

图3 黄芪治疗骨肿瘤的成分-靶点图

表6 黄芪活性成分及其预测靶点

2.8 信号通路富集 在GlueGO 里面导入35个预测靶点，设定每条通路里面最少靶点为5个，如图4所示，黄芪治疗骨肿瘤的主要富集在PI3K/Akt信号通路、RUNX2介导的转录调控、白介素4/13信号通路、EPH-Ephrin信号通路。

图4 主要靶点通路富集图

3 讨论

早在《五十二病方》中就有“骨睢（疽）”记载，中医将骨肿瘤归属“骨瘤”“骨疽”“石疽”“肉瘤”“石痈”等范畴。该病多由于先天禀赋不足，正气亏虚，寒湿毒邪乘虚而入，阻滞经络，结毒成瘤，留滞骨骼而成。治疗上多以健脾益气、补肾填精、清热利湿、活血化瘀、化痰散结之法，故多数医家遣方多用补虚药、清热药及活血化瘀药。

“邪之所凑，其气必虚”，正虚邪盛为骨肉瘤发生的重要病机，现代医家认为，扶正固本在骨肿瘤的治疗上尤为重要[6]。通过汇总骨肿瘤临床研究的文献，结果显示骨肿瘤的治疗中用药次数最多者为黄芪。黄芪在临床的应用可最早追溯至先秦的《五十二病方》，用于治疗疽病，《神农本草经》也记载了黄芪“主痈疽久败创，排脓止痛”之功效。现代药理学表明，黄芪可增强机体细胞及体液免疫，减少放化疗的毒副作用，促进肿瘤细胞凋亡[7]。通过高频药物聚类分析发现，第三类补益气血组合以八珍汤为主药，加益气固表之黄芪，以达到正气足则邪自去之功效。通过对高频药物关联规则分析，六对药物组合均以黄芪为主，或配伍养血、或配伍化瘀、或加以补肾、或加以益气，提示骨肿瘤的治疗常以益气、补肾、养血、化瘀相互配伍进行。

骨肿瘤病位在骨，多由于肾精亏虚、劳倦内伤、骨髓空虚，热毒、寒湿之邪气入侵，气血痰湿郁结所致[8]。聚类分析显示，第一类药物组合主要以六味地黄丸及阳和汤为主之补肾填精药。《外科正宗》有云：“肾主骨，恣欲伤肾，肾火郁遏，骨无荣养而为肿曰骨瘤。”又云：“多骨疽者，由疮溃久不收口，气血不能运行，骨无荣养所致。”表明肾气不足，肾阴亏虚是骨肿瘤发病的根本。骨肿瘤患者多以儿童及青少年为主，小儿阳常有余、阴常不足，六味地黄丸为滋阴补肾的首方，可作为治疗骨肿瘤的常用方剂。《灵枢》记载“阳化气，阴成形”“温气不行，凝血蕴里而不散，津液涩渗，著而不去，而积皆成矣”。现代医家认为，阳虚阴盛是肿瘤发生及转移的核心病机[9]。阳和汤温养阳气而不伤阴，填补精血而不留痰瘀，散寒而不耗散气血，并有减毒增效、抑制肿瘤转移、减轻癌痛之功效，为治疗恶性肿瘤的基本方[10]。肾为藏阴蕴阳之脏，无阳则阴无以生，无阴则阳无以化，在骨肿瘤的治疗中，巧用阳和汤可达到“寒凝一解，气血乃行，毒亦随之消”之功效。

肾为主水之脏，水液代谢失衡，则产生痰饮、水湿。痰湿之邪与肿瘤的产生密切相关，“久郁之痰，有年痼疾”，痰为湿化，多为阴邪，常留滞四肢关节，因此在骨肿瘤的治疗中，多辅以化痰利湿散结之药。高频药物中，半夏及竹茹，一温一寒，结合利湿之薏苡仁，散结之夏枯草，组成第二类药物组合，可达到湿去热消、痰瘀自散的效果。

骨肿瘤最主要的临床表现为肿胀、疼痛及活动受限。汇总结果显示，药味频数最高为甘味药，药性频次最高为温性药。甘能补、能缓，具有补益和中，缓急止痛之功效。正所谓“不通则痛”，温药多具有温里散寒、补火助阳、温通经络之功效，可在治疗上显著缓解骨肿瘤引起的疼痛。归经频数分析结果显示，高频药物多入肝、肾、脾胃经，肝主筋、肝藏血而濡养筋脉，肝虚血亏则可导致活动受限，肾主骨、肾精充足则骨骼得以滋养，肾虚可导致“不荣则痛”，脾主四肢，水谷清阳之气皆由脾气输布，脾气虚，则四肢失于温阳，可见肿胀不舒。因此，治疗骨肉瘤肿胀、肌力异常及术后恢复，多从肝、肾、脾胃经入手。

桦木酸是一种三萜类化合物，具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎等作用，可以促进肝癌细胞、卵巢细胞、胰腺癌细胞等凋亡[11-15]。本研究结果显示，黄芪治疗骨肿瘤的主要成分是桦木酸，而主要靶点为糖原合酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）。GSK-3β 是一种进化保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，在细胞增殖、DNA 修复、细胞周期、信号转导和代谢途径等方面发挥重要作用，并与肿瘤的发生密切相关，为软组织肉瘤的治疗靶点之一，其活化可促进骨肉瘤细胞的增殖[16-18]。Selzer 等[19]实验结果表明，桦木酸可以通过GSK-3β 促进人黑色素瘤细胞的凋亡。GSK-3β 作为PI3K/Akt 的主要靶点，可能被Akt介导的Ser 9残基磷酸化而失活，研究表明，PI3K/Akt/GSK-3β信号通路可抑制肿瘤细胞敏感性，从而促进乳腺癌的侵袭转移[20-21]。黄芪治疗骨肿瘤主要富集在PI3K/Akt信号通路，Cheng 等[22]认为，通过Akt/GSK-3β/Snail信号通路可以调节骨肉瘤细胞的侵袭转移。除此之外，黄芪治疗骨肿瘤的重要靶点有ESR1、PPARG、PTGS2，并通过RUNX2介导的转录调控、白介素4/13信号通路、EPH-Ephrin信号通路发挥作用，可作为黄芪治疗骨肿瘤的潜在研究机制。

综上所述，本研究通过汇总相关文献，发现在骨肉瘤治疗中，现代医家多从扶正固本入手，遣方多用补虚药、清热药及活血化瘀药，常用八珍汤、六味地黄丸及阳和汤，可为骨肿瘤的中医治疗提供理论基础。同时，通过网络药理学研究，初步分析了中医药治疗骨肿瘤高频用药为黄芪，其中活性成分桦木酸发挥了主要作用，并主要作用于GSK-3β，通过PI3K/Akt信号通路发挥作用，为中医药治疗骨肿瘤提供后续实验基础。然而纳入中医药治疗骨肿瘤的临床研究偏少，且骨肿瘤的实验设计、治疗分期存在差异，证型、症状等与用药关系尚未进一步研究，因此研究结果需要经过基础实验及完善的临床研究加以证实。