柚皮素对自身免疫性肝炎模型小鼠保护作用及TRAF6/JNK信号通路的影响

张露露 余真君 何宝泽

自身免疫性肝炎（AIH）是一种以肝细胞破坏为特征的自身免疫性炎症疾病，近年来其发病率在全球范围内呈上升趋势[1]。免疫抑制剂（泼尼松和硫唑嘌呤）是临床治疗AIH 的有效药物，但这些药物的骨髓抑制和库欣综合征等不良反应严重[2]。柚皮素是一种生物类黄酮，具有抗癌、抗诱变、抗炎和抗氧化等多种功能[3]。研究发现，柚皮素通过减少肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的积累和抑制细胞凋亡，对心肌缺血/再灌注损伤具有保护作用[4]。此外，柚皮素可以抑制四氯化碳诱导的小鼠肝脏脂质过氧化产物的损伤[5]。刀豆球蛋白A（ConA）是一种植物凝集素，可促进T细胞有丝分裂并诱导AIH[6]。当用ConA 处理小鼠时，肝脏释放白细胞介素-6（IL-6）、TNF-α和干扰素-γ（IFN-γ）等多种炎性细胞因子，从而导致肝组织发生凋亡和自噬[7]。因此，本研究探讨柚皮素在ConA 诱导的AIH 中的保护作用及肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）/c-Jun 氨基末端激酶（JNK）信号通路的潜在作用，为柚皮素治疗AIH 提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 72 只SPF 级雄性C57BL/6 小鼠，体质量25～30g，购自中国医药研究开发中心有限公司，动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0034，动物使用许可证号：SYXK（京）2019-0051，动物质量合格证号：HG50131702，在温度22～24℃、相对湿度50%～70%的环境中自由进食和饮水，控制饲养环境昼夜循环（12h/12h），适应性喂养1 周。本研究经台州恩泽医疗中心（集团）恩泽医院伦理委员会审核通过，批件编号：LS-2020（字）0037 号。

1.2 主要药物、试剂与仪器 柚皮素（原料药，纯度98%，湖南华腾制药有限公司，批号93602-28-9）；硫唑嘌呤（上海信谊药厂有限公司，规格：50mg/片，批号20200109）；ConA（美国Sigma 公司，批号11028-70）；丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）检测试剂盒（上海仁捷生物科技有限公司，批号080120、080122）；苏木精-伊红（HE）染色液（上海碧云天生物技术研究所，批号C0107）；IL-6和TNF-α 酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（北京方程生物科技有限公司，批号MM-0670R22、MM-0670R84）；RIPA 裂解液（上海生工生物工程有限公司，批号175056）；ECL 化学发光试剂盒（美国GE 公司，批号KL5179-23）；TRAF6、JNK、磷酸化JNK（p-JNK）、B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2 相关X 蛋白（Bax）和β-肌动蛋白（β-actin）抗体、山羊抗鼠二抗（美国Santa Cruz 公司，批号SC-5218、SC-5328、SC-5329、SC-4176、SC-5249、SC-6175、SC-0119）；全自动生化分析仪（日本Olympus 公司，型号AU2700）；组织脱水机、包埋机、全自动轮转切片机等病理配套设备（德国Leica 公司，型号ASP200S、EG1160、RM2265）；光学显微镜（日本Nikon 公司，型号MM-800）；台式冷冻离心机（德国Heraeus 公司，型号Sorvall STR ATOS）；酶标分析仪、垂直电泳仪（美国BIO-RAD 公司，型号xMark、1658000）；凝胶成像仪（美国UVP 公司，型号Gelstudio touch）。

1.3 分组、造模及给药 按照随机数字表法将72 只小鼠分为阴性对照组，模型组，柚皮素低（30mg/kg）、中（60mg/kg）、高（120mg/kg）剂量组[8]和阳性对照组（2mg/kg）[9]，每组12 只。模型组，柚皮素低、中、高剂量组和阳性对照组一次性尾静脉注射ConA（12mg/kg）制备AIH 模型[10]，阴性对照组尾静脉注射等量生理盐水。注射完毕之后，柚皮素低、中、高剂量组分别给予柚皮素（剂量依次为30、60、120mg/kg，将柚皮素和生理盐水配制成浓度分别为3、6、12mg/mL 的溶液，灌胃体积10mL/kg）灌胃；阳性对照组给予硫唑嘌呤（2mg/kg，将硫唑嘌呤和生理盐水配制成浓度为0.2mg/mL 的溶液，灌胃体积10mL/kg）灌胃；阴性对照组和模型组给予等量生理盐水灌胃，每天1 次，持续给予5 天。

1.4 血清ALT和AST 水平测定 末次灌胃24h 后眼静脉取血，离心（转速4500r/min，离心半径10cm）10min，分离血清，采用全自动生化分析仪酶法检测血清ALT和AST 水平。

1.5 HE 染色观察小鼠肝脏病理改变 末次灌胃24h 后，颈脱臼处死小鼠分离肝组织，将肝左叶用甲醛固定，其余肝组织液氮保存。肝左叶经甲醛固定24h 后，进行脱水、包埋，切片厚度1μm，常规HE 染色，观察肝组织病理学改变。

1.6 ELISA 法检测肝组织IL-6和TNF-α 水平 取冻存肝组织，制成匀浆，将相应一抗稀释至10μg/mL，加入到96 孔板中（0.1mL/孔），4℃过夜，洗涤3 次，加肝匀浆（0.1mL）于上述反应孔中，37℃孵育1h；加入新配置的相对应二抗0.1mL，孵育1h；加入新配置的3，3'，5，5'-四甲基联苯胺（TMB）底物溶液（0.1mL），显色（20min）；加入2mol/L 硫酸（0.05mL）终止反应，于450nm 处测各孔吸光度（A）值。

1.7 蛋白免疫印迹法检测肝组织TRAF6、JNK、p-JNK、Bcl-2和Bax 水平 取冻存肝组织，制成匀浆，按1∶9 的比例加入RIPA 裂解液，冰浴2h，离心（转速4500r/min，离心半径10cm）10min 后取上清，每管加入1/5 体积的5×Buffer，100℃煮10min 进行变性，进行电泳（20μg/孔），将印迹转移到聚偏氟乙烯膜上，然后用5%脱脂牛奶在室温下封膜1h，加入TRAF6、JNK、p-JNK、Bcl-2、Bax和β-actin 一抗（均为1∶500稀释）4℃孵育过夜，用山羊抗鼠二抗（1∶5000）在室温下孵育30min，进行显色，采集图像，通过Image LabTM 软件获取信号并估计强度，以β-actin 作为内对照。

1.8 统计学方法 应用统计软件SPSS 23.0 进行数据处理，实验数据采用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步组间两两比较用SNK-q 检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠血清ALT和AST 水平比较与阴性对照组比较，模型组小鼠血清ALT和AST 水平升高（P<0.05）；与模型组比较，柚皮素低、中、高剂量组和阳性对照组小鼠血清ALT和AST 水平降低，柚皮素各剂量组之间呈剂量效应关系（P<0.05）；柚皮素高剂量组与阳性对照组作用相似（P>0.05）。见表1。

表1 各组小鼠血清ALT和AST 水平比较（U/L，±s）

注：阴性对照组灌胃生理盐水；模型组灌胃生理盐水；柚皮素低剂量组灌胃30mg/kg 柚皮素；柚皮素中剂量组灌胃60mg/kg 柚皮素；柚皮素高剂量组灌胃120mg/kg 柚皮素；阳性对照组灌胃2mg/kg 硫唑嘌呤；ALT 为丙氨酸氨基转移酶；AST 为天冬氨酸氨基转移酶；与阴性对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与柚皮素低剂量组比较，cP＜0.05；与柚皮素中剂量组比较，dP＜0.05

2.2 各组小鼠肝脏病理改变比较 阴性对照组小鼠肝脏结构未见明显异常；模型组小鼠见大片肝细胞坏死，肝索排列紊乱，同时伴有炎性细胞浸润；柚皮素各剂量组和阳性对照组病理改变较模型组减轻，且柚皮素高剂量组与阳性对照组只存在轻度肝细胞坏死。见图1。

图1 各组小鼠肝脏病理图（HE 染色×200）

2.3 各组小鼠肝组织IL-6和TNF-α 水平比较与阴性对照组比较，模型组小鼠肝组织IL-6和TNF-α水平升高（P<0.05）；与模型组比较，柚皮素低、中、高剂量组和阳性对照组小鼠肝组织IL-6和TNF-α 水平降低，柚皮素各剂量组之间呈剂量效应关系（P<0.05）；柚皮素高剂量组与阳性对照组作用相似（P>0.05）。见表2。

表2 各组小鼠肝组织IL-6和TNF-α 水平比较（pg/mL，±s）

表2 各组小鼠肝组织IL-6和TNF-α 水平比较（pg/mL，±s）

注：阴性对照组灌胃生理盐水；模型组灌胃生理盐水；柚皮素低剂量组灌胃30mg/kg 柚皮素；柚皮素中剂量组灌胃60mg/kg 柚皮素；柚皮素高剂量组灌胃120mg/kg 柚皮素；阳性对照组灌胃2mg/kg 硫唑嘌呤；IL-6 为白细胞介素-6；TNF-α 为肿瘤坏死因子-α；与阴性对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与柚皮素低剂量组比较，cP＜0.05；与柚皮素中剂量组比较，dP＜0.05

2.4 各组小鼠肝组织TRAF6、JNK和p-JNK 蛋白水平比较 各组小鼠肝组织JNK 蛋白水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）；与阴性对照组比较，模型组小鼠肝组织TRAF6和p-JNK 蛋白水平增加（P<0.05）；与模型组比较，柚皮素低、中、高剂量组和阳性对照组小鼠肝组织TRAF6和p-JNK 蛋白水平降低，柚皮素各剂量组之间呈剂量效应关系（P<0.05）；柚皮素高剂量组与阳性对照组作用相似（P>0.05）。见表3、图2。

图2 各组小鼠肝组织TRAF6、JNK和p-JNK 蛋白表达印迹图

表3 各组小鼠肝组织TRAF6、JNK和p-JNK 蛋白水平比较（±s）

表3 各组小鼠肝组织TRAF6、JNK和p-JNK 蛋白水平比较（±s）

注：阴性对照组灌胃生理盐水；模型组灌胃生理盐水；柚皮素低剂量组灌胃30mg/kg 柚皮素；柚皮素中剂量组灌胃60mg/kg 柚皮素；柚皮素高剂量组灌胃120mg/kg 柚皮素；阳性对照组灌胃2mg/kg 硫唑嘌呤；TRAF6 为肿瘤坏死因子受体相关因子6；JNK 为c-Jun 氨基末端激酶；p-JNK 为磷酸化c-Jun 氨基末端激酶；与阴性对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与柚皮素低剂量组比较，cP＜0.05；与柚皮素中剂量组比较，dP＜0.05

2.5 各组小鼠肝组织Bcl-2和Bax 蛋白水平比较与阴性对照组比较，模型组小鼠肝组织Bcl-2 蛋白和Bcl-2/Bax 水平降低，Bax 蛋白水平增加（P<0.05）；与模型组比较，柚皮素低、中、高剂量组和阳性对照组小鼠肝组织Bcl-2 蛋白和Bcl-2/Bax 水平增加，Bax 蛋白水平降低，柚皮素各剂量组之间呈剂量效应关系，差异有统计学意义（P<0.05）；柚皮素高剂量组与阳性对照组作用相似（P>0.05）。见表4、图3。

表4 各组小鼠肝组织Bcl-2和Bax 蛋白水平比较（±s）

表4 各组小鼠肝组织Bcl-2和Bax 蛋白水平比较（±s）

注：阴性对照组灌胃生理盐水；模型组灌胃生理盐水；柚皮素低剂量组灌胃30mg/kg 柚皮素；柚皮素中剂量组灌胃60mg/kg 柚皮素；柚皮素高剂量组灌胃120mg/kg 柚皮素；阳性对照组灌胃2mg/kg 硫唑嘌呤；Bcl-2 为B细胞淋巴瘤/白血病-2；Bax 为B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X 蛋白；与阴性对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与柚皮素低剂量组比较，cP＜0.05；与柚皮素中剂量组比较，dP＜0.05

图3 各组小鼠肝组织Bcl-2和Bax 蛋白表达印迹图

3 讨论

柚皮素是一种草药提取物，具有显著的抗炎和抗氧化活性，已有研究证明柚皮素对肝损伤具有保护作用，通过抑制核转录因子-κB（NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，发挥抗肝细胞凋亡作用[11]。同时，柚皮素通过阻止NADPH 氧化酶1（Nox1）蛋白质的产生，对胆总管结扎（BDL）诱导的肝损伤具有炎症抑制作用[8]。

AIH 的发病主要是由于免疫调节功能紊乱，免疫系统以肝脏自身抗原为靶点，引起不可控制的免疫反应，从而导致肝脏持续损伤，而炎症是肝细胞损伤的重要机制之一[12]，炎性细胞因子（TNF-α、IFN-γ和IL-6）在ConA 致肝损伤的发病机制中发挥重要作用[13]。肝细胞损伤后，ALT和AST 均被释放，这些标记物被广泛用于肝损伤检测[14]。本研究发现，模型组小鼠血清ALT、AST和肝组织IL-6、TNF-α 水平高于阴性对照组，柚皮素低、中、高剂量组小鼠血清ALT、AST和肝组织TNF-α和IL-6 水平低于模型组。组织病理学证据也表明，柚皮素各剂量组小鼠肝脏炎症和肝细胞坏死明显减轻。因此，柚皮素在ConA 诱导的炎症性肝损伤中起着明显的抗炎作用。

TRAF6 是一种细胞质衔接蛋白，在哺乳动物组织中广泛表达，被认为是许多具有免疫调节功能的受体家族的下游因子，可以激活多种信号传导途径，包括JNK 途径[15]。TRAF6 的表达与癌症和自身免疫性疾病等多种疾病密切相关。通过抑制TRAF6 的表达，可以有效减轻肝脏损伤[16]。此外，TRAF6 敲低可阻断Toll 样受体4（TLR4）诱导的JNK 磷酸化[17]。TRAF6/JNK信号传导是许多系统疾病的关键潜在机制之一。p-JNK 是JNK 的活性形式，在ConA 注射后产生p-JNK，并转移到核膜或线粒体膜上，引起肝脏损害[18]。凋亡对于炎症相关的肝病至关重要，可由内源性或外源性因素诱导。p-JNK 可以转运至线粒体膜，使Bcl-2 失活，导致细胞色素C（Cyt C）的释放，启动半胱氨酸蛋白酶（caspases）介导的凋亡[19]。本研究发现，模型组小鼠肝组织TRAF6、p-JNK和Bax 蛋白水平高于阴性对照组，Bcl-2 蛋白和Bcl-2/Bax 水平低于阴性对照组；柚皮素低、中、高剂量组小鼠肝组织TRAF6、p-JNK和Bax 蛋白水平低于模型组，Bcl-2 蛋白和Bcl-2/Bax 水平高于模型组。提示柚皮素可能通过抑制TRAF6 的表达，从而抑制JNK 的磷酸化，抑制肝细胞凋亡，减轻ConA 诱导的肝损伤。

综上所述，柚皮素可能通过抑制TRAF6/JNK信号通路，减轻AIH 模型小鼠肝脏炎症反应，抑制肝细胞凋亡，发挥肝脏保护作用，可能是治疗AIH 的潜在治疗药物，但其临床应用仍需大量研究来论证。