巴戟天醇提物通过MAPK/ERK信号通路对脑缺血再灌注模型大鼠的保护作用

龚 鸣

脑卒中是威胁中国居民身体健康和生命安全的重大疾病之一，其中约70%脑卒中患者为脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusiorc injury，CIRI），死亡率约10%，致残率高达50%以上[1]。CIRI 指脑缺血一定时间恢复血液供应后，脑功能并未好转，反而出现更严重功能障碍的现象[2]。CIRI 是缺血性脑血管病的主要病理过程，可通过炎症反应、凋亡激活、细胞氧化、线粒体损伤等引起神经细胞死亡[3]。巴戟天醇提物（radix Morindae officinalis-ethanolic extract，RMOEE）来源于双子叶植物茜草科植物巴戟天，已有研究表明，其对心脏、肾脏的缺血再灌注损伤具有一定的保护作用[4-5]。本研究通过构建脑缺血再灌注大鼠模型，探究RMOEE 对CIRI 的保护机制。

1 实验材料

1.1 动物 健康清洁级雄性SD 大鼠40 只，体质量200～240g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物生产许可证号为SCXK（沪）2013-0018，动物使用许可证号为SYXK（浙）2018-0012。饲养于浙江中医药大学实验动物研究中心，室温（25±2）℃，相对湿度60%～70%。

1.2 药物 中药巴戟天购自安徽亳州中药材市场。参考文献[6]的方法进行提取，巴戟天干燥后反复粉碎，得到的粉状物过100 目筛，与70%乙醇按体积比1∶10 混合，采用热回流法将上清液过滤，旋蒸去除乙醇得到浸膏状物。分别加入蒸馏水和正丁醇萃取3次后，得到醇提物正丁醇萃取部分和醇提物水溶部分，再次旋蒸得到各部分浓缩物，将RMOEE 水溶部分配成浓度为2g/mL 的母液备用。

1.3 试剂和仪器 水合氯醛购自美国Sigma 公司（批号为A5462），大鼠炎症因子[肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）]检测试剂盒购自上海信帆生物科技有限公司（批号分别为201604、201803、201612、201701、201608），2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）、苏木素-伊红（HE）染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司（批号分别为10110034、0321A23），原位末端转移酶标记（TUNEL）染色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司（批号为P0173），抗体[丝裂原活化蛋白激酶1/2（MEK1/2）、激活型MEK1/2（p-MEK1/2）、细胞外调节蛋白激酶1/2（ERK1/2）、激活型ERK1/2（p-ERK1/2）、B 淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2 关联X 蛋白（Bax）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、半胱氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）]为兔抗，均购自美国CST 公司（批号分别为4694、2338、4695、9101、3498、14796、9662、9502、2858），Infinite M200 PRO 型多功能酶标仪购自奥地利TECAN 公司，转移脱色摇床购自姜堰市普康医疗机械厂，PowerPac Basic 电泳仪购自美国BIO-RAD 公司，3300 Mini 化学发光成像系统购自中国CLinX 公司。

2 实验方法

2.1 分组、造模及给药 40 只SD 大鼠按照随机数字表法分为假手术组、模型组及RMOEE 低、中、高（3、6、12g/kg）剂量组，每组8 只。参考文献[7]线栓法制备脑缺血再灌注大鼠模型。由尾部将大鼠提起，保持悬空，左前肢屈曲内收，活动时呈典型追尾征为造模成功。假手术组除不插线外，其余步骤同模型组和RMOEE 低、中、高剂量组。另外，RMOEE 低、中、高剂量组按照3、6、12g/kg 的药物剂量，于每天上午8:30进行灌胃给药，持续21 天，假手术组与模型组给予等体积5g/L 羧甲基纤维素钠溶液。

2.2 神经功能缺失评分 给药结束后，采用Zea Longa 评分标准[8]对大鼠神经功能进行评分。无神经功能缺损症状计0 分；瘫痪侧屈曲、内收，不能自主伸展计1 分；行走时向瘫痪侧转圈计2 分；行走时向瘫痪侧倾倒计3 分；严重神经功能缺损，如行走障碍等计4 分。得分越高表明神经功能缺失越严重。

2.3 脑含水量检测 采用脑组织干湿重法检测各组大鼠脑含水量，将各组大鼠麻醉后断头、取脑，去除小脑和低位脑干后称重大脑组织重量，即为脑湿重；110℃恒温烘烤48h 后称重为脑干重，计算脑含水量：脑含水量（%）=（脑湿重－脑干重）/脑湿重×100%。

2.4 脑梗死体积百分比测定 采用TTC 染色法检测脑梗死体积，取脑后于-20℃放置30min，除去小脑和嗅球，冠状切片，从大脑的额叶至枕叶连续切5片。随后将脑片放入1%的TTC 磷酸缓冲液中，37℃避光孵育5min，待颜色分明后取出（梗死区呈白色），用10%甲醛固定。采用Image Pro-Plus 测量梗死面积和整个大脑面积，体积=面积×厚度。脑梗死体积百分比=（梗死体积/整个大脑体积）×100%。

2.5 炎症因子表达情况检测 各组大鼠断头后，取缺血侧脑组织，研磨匀浆，4℃下离心（3500r/min）5min，取上清液，按照ELISA 试剂盒说明书进行操作，通过酶标仪测定大鼠缺血侧脑组织中TNF-α、IL-1β、ICAM-1 及VCAM-1 的含量。

2.6 HE 染色及TUNEL 染色 于冰上取脑后部分组织，利用10%多聚甲醛固定，经过脱水浸蜡包埋后制备石蜡切片，连续切片后进行脱蜡水化处理，切片厚度为4μm。然后进行脱蜡、二甲苯浸泡，降梯度乙醇溶液脱水处理，随后按照HE 染色试剂盒说明书进行操作，采用中性树胶封片后通过显微镜观察脑组织海马CA1 区神经元病变；切片后采用4%多聚甲醛，PBS 清洗，Triton X-100通透，按照TUNEL 试剂盒说明书步骤进行染色，检测凋亡情况，胞浆中呈现有棕黄色底物的细胞视作阳性凋亡细胞，利用Image Pro-Plus 分析软件统计其中TUNEL 阳性细胞个数，取其平均值作为该样本的阳性细胞数，凋亡细胞百分率（%）=阳性凋亡细胞数/（阳性凋亡细胞数+阴性凋亡细胞数）×100%。

2.7 Western blot 检测相关蛋白表达 取大鼠患侧脑皮质组织，加入适量液氮，用研钵研磨后加入Lysis Buffer，组织匀浆机中进行匀浆，使组织尽量碾碎，冰上静置裂解15～30min。将匀浆液放入离心管中离心5min，取上清转移至新的预冷的离心管中，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度，处理蛋白随后上样。用SDSPAGE 分离总蛋白，随后用湿转法转移至PVDF 膜上，一抗4℃过夜，二抗室温孵育2h 后采用ECL 显色液显影，化学发光成像系统上进行曝光拍照后，采用Image J 软件进行灰度值分析。

2.8 统计学方法 应用SPSS 22.0 统计软件进行数据分析，数据以均数±标准差（±s）表示，不同组间两两比较采用单因素方差分析；组间两两比较，方差齐性者采用两独立样本t 检验，方差不齐者采用Kruskal-Wallis H 检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组大鼠神经功能缺失评分及脑含水量比较与假手术组比较，模型组大鼠神经功能评分显著升高（P<0.01）；与模型组比较，RMOEE 低、中、高剂量组均有不同程度地降低（P<0.05 或P<0.01）。与假手术组比较，模型组大鼠脑含水量显著增加（P<0.01）；与模型组比较，RMOEE 中、高剂量组脑含水量显著降低（P<0.05）。见表1。

表1 各组大鼠神经功能缺失评分及脑含水量比较（±s）

表1 各组大鼠神经功能缺失评分及脑含水量比较（±s）

注：假手术组和模型组予5g/L 羧甲基纤维素钠溶液灌胃；RMOEE 低、中、高剂量组分别按照3、6、12g/kg 的剂量予RMOEE 溶液灌胃；Zea Longa 为神经功能缺失评分；RMOEE 为巴戟天醇提物；与假手术组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.05，bbP<0.01

3.2 各组大鼠脑梗死体积百分比比较 假手术组无明显白色梗死灶出现，模型组可见明显的白色梗死灶，各RMOEE 加药组中白色梗死灶大小均有不同程度的减小（见图1）。与假手术组比较，模型组大鼠脑梗死体积百分比显著增加（P<0.01）；与模型组比较，RMOEE 中、高剂量组脑梗死体积百分比显著降低（P<0.05 或P<0.01）。见表2。

图1 各组大鼠脑组织TTC 染色情况

表2 各组大鼠大脑梗死体积百分比比较（%，±s）

表2 各组大鼠大脑梗死体积百分比比较（%，±s）

注：假手术组和模型组予5g/L 羧甲基纤维素钠溶液灌胃；RMOEE 低、中、高剂量组分别按照3、6、12g/kg 的剂量予RMOEE 溶液灌胃；RMOEE 为巴戟天醇提物；与假手术组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.05，bbP<0.01

3.3 各组大鼠脑组织炎症因子表达比较与假手术组比较，模型组大鼠脑组织TNF-α、IL-1β、ICAM-1及VCAM-1 的表达量显著升高（P<0.01）；与模型组比较，RMOEE 中、高剂量组能够显著降低大鼠脑组织TNF-α、IL-1β、ICAM-1 及VCAM-1表达（P<0.05）。见表3。

表3 各组大鼠脑组织炎症因子表达比较（±s）

表3 各组大鼠脑组织炎症因子表达比较（±s）

注：假手术组和模型组予5g/L 羧甲基纤维素钠溶液灌胃；RMOEE 低、中、高剂量组分别按照3、6、12g/kg 的剂量予RMOEE 溶液灌胃；RMOEE为巴戟天醇提物；TNF-α 为肿瘤坏死因子-α；IL-1β 为白细胞介素-1β；ICAM-1 为细胞间黏附分子-1；VCAM-1 为血管细胞黏附分子-1；与假手术组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.05

3.4 各组大鼠海马CA1 区神经元病理学形态变化HE 染色结果显示，假手术组大鼠脑组织海马CA1区神经元结构层次清晰，排列整齐，结构完整，胞质染色均匀，无异常现象。而模型组神经元结构明显异常，排列紊乱，神经元数量减少，间隙增大，胞体肿胀变形，核仁变浅或消失。相比于模型组，RMOEE 各剂量组能够有效改善海马CA1 区神经元的病理学改变，且随着剂量的增大，改善效果逐渐明显。见图2。

图2 各组大鼠海马CA1 区神经元病理学形态变化（HE 染色×200）

3.5 各组大鼠脑组织细胞凋亡率比较与假手术组比较，模型组大鼠脑组织细胞凋亡率显著增高（P<0.01）；相对于模型组，RMOEE 低、中、高剂量组细胞凋亡率均显著降低（P<0.05）。见表4，图3。

表4 各组大鼠脑组织细胞凋亡率比较（%，±s）

表4 各组大鼠脑组织细胞凋亡率比较（%，±s）

注：假手术组和模型组予5g/L 羧甲基纤维素钠溶液灌胃；RMOEE 低、中、高剂量组分别按照3、6、12g/kg 的剂量予RMOEE 溶液灌胃；RMOEE 为巴戟天醇提物；与假手术组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.05

图3 各组大鼠脑组织细胞凋亡情况（TUNEL 染色×400）

3.6 各组大鼠脑组织相关蛋白表达比较 Western blot 检测结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠p-MEK1/2、p-ERK1/2、Bax、Caspase-3 以及Caspase-9蛋白表达量显著增加（P<0.05 或P<0.01），Bcl-2 蛋白含量显著降低（P<0.05）；与模型组比较，RMOEE 中、高剂量组p-MEK1/2、p-ERK1/2、Bax、Caspase-3 以及Caspase-9 蛋白含量显著下降（P<0.05 或P<0.01），Bcl-2 蛋白含量显著增高（P<0.05 或P<0.01）。见图4，表5。

图4 各组大鼠脑组织中相关蛋白表达情况

表5 各组大鼠脑组织相关蛋白相对表达量比较（±s）

表5 各组大鼠脑组织相关蛋白相对表达量比较（±s）

注：假手术组和模型组予5g/L 羧甲基纤维素钠溶液灌胃；RMOEE 低、中、高剂量组分别按照3、6、12g/kg 的剂量予RMOEE 溶液灌胃；RMOEE为巴戟天醇提物；MEK1/2 为丝裂原活化蛋白激酶1/2；p-MEK1/2 为激活型丝裂原活化蛋白激酶1/2；ERK1/2 为细胞外调节蛋白激酶1/2；p-ERK1/2 为激活型细胞外调节蛋白激酶1/2；Bcl-2 为B 淋巴细胞瘤-2；Bax 为Bcl-2 关联X 蛋白；Caspase-3 为半胱氨酸蛋白酶-3；Caspase-9为半胱氨酸蛋白酶-9；GAPDH 为甘油醛-3-磷酸脱氢酶；与假手术组比较，aP<0.05，aaP<0.01；与模型组比较，bP<0.05，bbP<0.01

4 讨论

中医药在治疗脑缺血再灌注方面有着独特的作用和优势[9-11]，中药巴戟天是茜草科巴戟天属植物巴戟天的干燥根，味甘、辛，微温，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿等功效[12]，其醇提物已被证实对大鼠CIRI 具有一定的保护作用[13]，然而其具体的作用机制未被阐明。本研究结果表明，RMOEE 能够显著降低脑缺血再灌注大鼠的Zea Longa 评分，明显减少脑含水量以及脑梗死体积百分比，提示RMOEE 能够在一定程度上减轻脑缺血再灌注所造成的神经功能损伤，改善脑水肿以及脑梗死情况。HE 染色结果表明，RMOEE 干预能够改善脑缺血再灌注模型大鼠脑组织海马CA1 区神经元的病理学改变。

炎症因子的释放加剧了血脑屏障的通透性，进而加重脑组织水肿，促使炎症因子透过血脑屏障，加重炎症反应和细胞凋亡[14]。细胞凋亡是CIRI 引起神经细胞死亡的重要原因[15]。因此，炎症反应和细胞凋亡与CIRI 密切相关。本研究检测大鼠脑组织炎症因子（TNF-α、IL-1β、ICAM-1 及VCAM-1）的表达变化，结果表明，模型组大鼠炎症因子表达明显增高，而RMOEE 干预后能够有效降低上述炎症因子的表达，证实RMOEE 能够显著抑制模型大鼠脑缺血再灌注所造成的炎症反应。此外，TUNEL 染色结果表明RMOEE 能够有效降低脑缺血再灌注模型大鼠的细胞凋亡率，并通过Western blot 实验从蛋白层面验证了RMOEE 干预能够抑制脑缺血再灌注模型大鼠细胞凋亡。

MAPK/ERK信号通路是由激酶级联反应介导的信号传导通路，能够通过一系列的级联反应，激活靶基因转录，参与细胞增殖、转移、凋亡等过程[16]。目前已有研究证实，MAPK/ERK信号通路的异常激活与CIRI 密切相关[15]。MEK1/2和ERK1/2 是MAPK/ERK信号通路的标志性蛋白。本研究结果表明，相对于假手术组，模型组大鼠MEK1/2和ERK1/2 的磷酸化水平显著增强，表明MAPK/ERK通路在脑缺血再灌注模型大鼠中呈异常激活状态，而RMOEE 能够明显降低p-MEK1/2和p-ERK1/2 的表达，证明RMOEE能够有效抑制MAPK/ERK通路活性。

综上所述，RMOEE 可能通过调控MAPK/ERK信号通路，降低炎症因子表达以及抑制凋亡，进而对大鼠CIRI 起到一定的保护作用。