慢律升颗粒对慢性心律失常模型大鼠血浆环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷的影响

蒋 宁，杨 光，彭彩亮，林 林，胡喜姣

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001)

慢性心律失常是以心率减慢为主要特征的一类心脏传导系统疾病，由房室结或窦房结自律性低下或传导系统阻滞引起，主要包括房室或窦房传导阻滞、窦性心动过缓、病态窦房结综合征等，临床主要表现为心悸、头晕、黑蒙、晕厥甚至导致患者死亡[1]。目前尚无满意的抗心律失常药物，长期应用口服药有诱发新的心律失常或加重原有病情的风险，此外安装起搏器费用较高，较难普及[2]。中医疗法因安全性、临床疗效均较好逐渐成为研究热点。慢性心率失常归属中医“怔忡”“昏厥”“眩晕”“心悸”范畴，主要病机是心肾阳虚，因此活血化瘀、温肾助阳是慢性心律失常的主要治疗原则[3]。慢律升颗粒是临床经验方，具有益气活血、温肾助阳之功效[4]。环磷酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate，cAMP)、环磷酸鸟苷(Cyclic guanosine monophosphate，cGMP)是一对相互拮抗、相互对立的物质，cAMP是细胞内“第二信使”，具有扩张血管、抗心律失常等多重作用，cGMP可通过激活蛋白激酶G降低心搏率[5]。本研究通过建立慢性心律失常大鼠模型，探究慢律升颗粒对慢性心律失常模型大鼠血浆cAMP、cGMP的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：30只健康无特定病原体动物SPF级雄性SD大鼠(购自黑龙江中医药大学动物中心)，体重(200±20)g，分笼饲养于普通环境中。动物实验操作流程通过黑龙江中医药大学动物伦理委员会批准开展。

1.1.2 主要试剂与仪器：所用试剂主要包括盐酸普萘洛尔片(国药准字H3020584)、注射用青霉素钠(国药准字H3021633)、水合氯醛(纯度为99.8%,天津市大茂化学试剂厂)、碘伏(河北瑞康医药科技有限公司)、RIPA裂解液(上海贝博生物公司)、Protein Marker(Aomabio公司)、PVDF膜(美国Milipore公司)、Cx45蛋白抗体(Abclonal公司)、Gsα蛋白抗体、羊抗兔IgG(美国Affinnity公司)、HCN蛋白抗体(Gene公司)、DAS显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(杭州联科生物技术有限公司)、SDS-PAGE凝胶配置试剂盒(碧云天生物技术有限公司)、Potent ECL高敏化学噶光试剂盒(杭州联科生物技术有限公司)、cAMP试剂盒和cGMP试剂盒(江苏酶标生物科技有限公司)。

慢律升颗粒：红参、三七粉、芍药、细辛各5 g，炙附子、炙麻黄各7.5 g，葛根、丹皮、泽泻各20 g，炙甘草10 g。慢律升颗粒由黑龙江中医药大学附属第一医院制剂室制备。

仪器：BL-420F生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司)、凝胶成像系统(Aplegen公司)、酶标仪(Tecan公司)、BMJ-1B生物组织包埋机(天津天利航空机电有限公司)、离心机(型号5425，德国Eppendorf公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 建模与分组：大鼠在普通环境适应性饲养1周后，随机分为对照组、普萘洛尔组、乙酰胆碱组、普萘洛尔联合慢律升组、乙酰胆碱联合慢律升组，各6只。普萘洛尔组、乙酰胆碱组、普萘洛尔联合慢律升组和乙酰胆碱联合慢律升组大鼠术前禁食12 h，称重后腹腔注射0.3 ml/100 g的10%水合氯醛麻醉，麻醉后将大鼠以仰卧位固定，颈部剃毛、消毒。除对照组外，将其余各组大鼠的喉部沿喉管方向切开约1.5 cm的小口，将肌肉充分暴露，顺着喉咙方向将肌肉分开，暴露气管，找出甲状腺软骨下方与气管连接的甲状腺，游离出气管两侧甲状腺上下极并将上下极静脉和动脉剥离，使用细线结扎血管，小心分离甲状腺，若有出血需立即止血，止血后将伤口缝合。缝合后术口碘伏消毒，术后予小鼠注射青霉素预防感染。术后第28天大鼠出现以下症状：嗜睡、食欲减退、蜷缩、体温下降、皮毛无华、心率减慢等。术后第29天起，普萘洛尔组、普萘洛尔联合慢律升组大鼠每天上午给予盐酸普萘洛尔15 mg/kg灌胃，乙酰胆碱组、乙酰胆碱联合慢律升组大鼠每天上午给予乙酰胆碱15 mg/kg灌胃，均连续给药7 d，当心率低于300次/min或心电图示RR间期大于60 ms时，即表示慢性心律失常大鼠模型造模成功。本实验24只大鼠均造模成功。

1.2.2 给药：大鼠造模成功后第2天立即给药。对照组大鼠分别于上午和下午灌胃0.9%氯化钠溶液1 ml/100 g；普萘洛尔组大鼠上午灌胃盐酸普萘洛尔15 mg/kg，下午灌胃0.9%氯化钠溶液1 ml/100 g；乙酰胆碱组大鼠上午灌胃乙酰胆碱15 mg/kg，下午灌胃0.9%氯化钠溶液1 ml/100 g；普萘洛尔联合慢律升组大鼠上午灌胃盐酸普萘洛尔15 mg/kg，下午灌胃慢律升颗粒，1袋/次；乙酰胆碱联合慢律升组大鼠上午灌胃乙酰胆碱15 mg/kg，下午灌胃慢律升颗粒，1袋/次。各组大鼠均连续灌胃7 d。

1.2.3 cAMP和cGMP水平检测：第7天上午各组大鼠灌胃后2 h，称重、麻醉，用手术剪剪开腹部皮肤，逐层分离腹部肌肉组织，显露腹主动脉，用一次性采血针于腹主动脉采血，将血液离心10 min、3000 r/min，取上清液放置-20 ℃冰箱中备用。采用酶联免疫吸附法检测大鼠血清中cAMP和cGMP含量。

1.2.4 肛温及心率检测：于治疗后，使用体温计测定并记录各组大鼠肛温，使用BL-420F生物机能实验系统检测并记录各组大鼠心率。

<1)，且各件产品是否为不合格品相互独立．

2 结 果

2.1 各组大鼠一般情况比较 对照组大鼠毛皮光亮，饮食和大小便均正常，体型强健，活动及打斗频繁，体重增长较快。除对照组外，其余组大鼠毛皮色暗黄、枯燥无光泽，大便稀，肛门黏着稀便，精神萎靡，活动及打斗较少，体型瘦小，体重增长较慢。

2.2 各组大鼠肛温、心率比较 与对照组比较，普萘洛尔组、乙酰胆碱组大鼠的肛温均低(P<0.05)；与普萘洛尔组、乙酰胆碱组比较，普萘洛尔联合慢律升组、乙酰胆碱联合慢律升组治疗后肛温均高(P<0.05)。与对照组比较，普萘洛尔组、乙酰胆碱组大鼠的心率均低(P<0.05)；与普萘洛尔组、乙酰胆碱组比较，普萘洛尔联合慢律升组、乙酰胆碱联合慢律升组治疗后心率均高(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠肛温、心率比较

2.3 各组大鼠血清中cAMP、cGMP及cAMP/cGMP水平比较 见表2。与对照组比较，普萘洛尔组、乙酰胆碱组大鼠的cAMP低，cGMP高，cAMP/cGMP比值低，差异有统计学意义(均P<0.05)。与普萘洛尔组、乙酰胆碱组比较，普萘洛尔联合慢律升组、乙酰胆碱联合慢律升组治疗后cAMP水平高，cGMP水平低，cAMP/cGMP比值高，差异有统计学意义(均P<0.05)。

表2 各组大鼠血清中cAMP、cGMP及cAMP/cGMP水平比较

3 讨 论

慢性心律失常在中医归属于“眩晕”“胸痹”“心悸”等范畴，主要临床特征为长期的脉搏缓慢且不规则，并伴有心悸、胸闷、头晕耳鸣、腰膝酸软、畏寒肢冷、晕厥等症状[6]。古代医家认为心为君主之官，主血脉，心阳鼓动营血周而复始地流动；肾阳是人体阳气之根本，在人体生命活动中占据重要位置，心阳根于肾阳，人至中年阳气渐亏，心之搏动节律减缓，因此心肾阳虚是本病的主要病因病机[7]。

本研究结果显示，予慢律升颗粒治疗后，大鼠的肛温和心率与相应的模型组比较均显著升高，提示慢律升颗粒可以提高慢性心律失常模型大鼠的肛温和心率。这可能与慢律升颗粒温阳通脉、补益活血之功效相关。慢律升颗粒主要成分为红参、炙附子、葛根、芍药、细辛、炙麻黄、丹皮、泽泻、炙甘草[8]。红参为君药，有补脾益气、大补元气及生津安神功效；炙附子为臣药，具有补火助阳、回阳救逆、散寒的功效；葛根可升阳解肌，芍药、丹皮具有活血散瘀止痛、清热凉血之功，炙麻黄和细辛宣肺平喘、发汗解表、利水消肿，可散阴寒以调血脉，助附子发越阳气，促进血脉的运行，泽泻具有泻热、利水渗湿功效，炙甘草有补心益脾功效，可调和诸药，以上诸药共为佐使，全方共奏温阳通脉、补益活血之功效[9-11]。现代药理学研究表明，慢律升颗粒通过温阳可使心率增加，加强心脉运行，改善血流滞缓状态[12]。

本研究结果显示，慢律升颗粒治疗后大鼠cAMP、cAMP/cGMP水平与模型组大鼠比较均显著升高，cGMP水平均显著低于相应模型组，提示慢律升颗粒可以提高血清中cAMP水平，降低血清中cGMP水平，使cAMP/cGMP升高。分析原因可能是，慢性心律失常与支配心脏的交感神经和迷走神经功能失常相关，同时由于心肌细胞膜对K+通透性增高及房室交界细胞膜处于超极化状态，不易爆发动作电位有关[13]。乙酰胆碱作用于M受体，兴奋迷走神经，从而抑制心脏兴奋，降低心率，引发慢性心律失常[14]。环核苷酸包括cAMP和cGMP，是体内具有广泛调节作用的生物活性物质，可以将第1信使传来的信号从细胞膜传递至细胞内，进而影响细胞内酶活性，调节细胞的各种生物学功能[15-16]。cAMP和cGMP是相互拮抗的物质，血清中cAMP含量降低时，cGMP含量会增加，cAMP/cGMP降低，是阳虚证特异性的病理变化之一[17]。cAMP是细胞内“第二信使”，具有强心、抗心律失常、扩张血管及正性肌力作用，可通过激活蛋白激酶A调节钙通道和钠通道，增强磷酸化状态，进而提高心率，且cAMP促进自由脂肪酸的生成，增加心肌耗氧量[18]。cGMP可通过激活蛋白激酶G抑制肌纤维膜蛋白的磷酸化，进而降低心搏率[19]。现代药理研究表明，葛根有抗心律失常的作用，炙甘草可使窦房结自律性增加，进而提高心率[20]。

综上，慢律升颗粒可以升高慢性心律失常模型大鼠的肛温和心率，提高血清cAMP、cAMP/cGMP水平，降低血清cGMP水平。