培元抗癌汤联合替加氟对小鼠H22肝癌细胞生长的抑制作用

司海龙，马仰仰，马一鸣，张 洁，肖海娟，方 瑜，王惠玲

(陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046)

恶性肿瘤已成为影响人类健康和生命的重大疾病，随着研究的深入,肿瘤微环境(Tumor microenvironment，TME)逐渐被人们认识[1-2]。TME是由多种基质细胞及细胞因子构成的复杂生物学系统,影响着肿瘤发展进程中的多种生物学行为，为肿瘤增殖、血管生成、侵袭、转移提供了良好的物质条件[3]。中医药在重塑肿瘤相关微环境及控制肿瘤复发、转移等方面有着重要优势[4]。癌相关成纤维细胞(Cancer associated fibroblasts,CAFs)是TME中最主要的基质细胞之一，在肿瘤发展过程中起着重要作用[5]。研究表明α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)作为癌相关成纤维细胞(Cancer associated fibroblasts,CAFs)表达的特征性蛋白标志物，常用以CAFs检测[6]。而波形蛋白(Vimentin)作为细胞骨架蛋白的一类Ⅲ型中间丝蛋白，在临床病理学鉴别肿瘤细胞分化起源过程中被广泛的作为标志物[7]。因此可以通过检测α-SMA、Vimentin蛋白表型间接检测CAFs，从而反映其在肿瘤微环境变化和对肿瘤发生、发展、转移及预后的影响。CAFs可以分泌多种趋化因子，趋化因子由可溶性及分子量较小的细胞因子样蛋白构成，分泌的CXCL1、CXCL2、CXCL8以及CAFs可以诱导肿瘤形成，促进肿瘤细胞增殖、转移及血管新生[8-10]。研究发现，下调CXCL可以显著抑制肿瘤细胞生长及转移[11]。培元抗癌汤是陕西省名中医李仁廷教授根据30余年中医药治疗恶性肿瘤临床经验所研制。前期临床研究证实培元抗癌汤联合FOLFOX4方案化疗治疗中晚期肝癌，疗效优于单纯FOLFOX4方案化疗[12]。前期动物实验研究表明培元抗癌汤通过干预不同的因子，抑制H22肝癌细胞生长，提高免疫功能。本研究在前期研究基础上，以H22荷瘤小鼠为载体，应用现代生物学技术与方法，观察培元抗癌方联合替加氟片对肿瘤生长及转移的抑制作用，检测CAFs及相关细胞因子CXCL1、CXCL2、CXCL8的表达，探讨培元抗癌汤治疗肝癌的作用机理，为培元抗癌方治疗恶性肿瘤提供现代生物学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物及细胞株：肝癌细胞株H22，由陕西中医药大学实验中心提供；昆明种雄性小鼠40只，体重18～22 g，购于西安交通大学医学院实验动物中心，合格证号SCXK(陕2017-003)；在陕西中医药大学动物实验中心进行饲养，室内平均温度(23±2)℃、平均湿度(55±10)%，饲养1周后造模。

1.1.2 实验药物与试剂：替加氟片(国药准字H20066150，规格50 mg/片)。培元抗癌汤组成：西洋参、黄芪、炒白术、莪术、白花蛇舌草、茯苓各15 g，郁金、厚朴、法半夏、焦山楂各12 g，方中中草药购于陕西中医药大学附属医院。蛋白Marker(北京全式金生物技术有限公司)，兔多抗Gapdh(杭州贤至生物有限公司)，兔单抗CXCL2(Invitrogen公司)，兔多抗CXCL8(Affinity公司)，兔多抗CXCL1、α-SMA、Vimentin(三鹰生物公司)，HRP标记羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.1.3 实验仪器：电泳仪电源(北京六一仪器厂)、DYY-7C垂直电泳槽(北京六一仪器厂)、DYCZ-24DN电转仪(北京六一仪器厂)、水平摇床(海门其林贝尔仪器制造有限公司)、pH计(德国Metter-Toledo GmbH公司)、酶标仪(Thermo公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 H22腹水型瘤株悬液制备：在无菌环境下，将鼠源性肝癌细胞株H22注入Balb/c小鼠腹腔内,荷瘤10 d；荷瘤小鼠腹水异常增加时,处死小鼠并收集腹水,在22 ℃条件下,30 min内用0.9%氯化钠溶液洗3次，再用0.9%氯化钠溶液调整浓度为1×106/ml癌细胞悬液,通过台盼蓝染色证实H22细胞存活率>95%，置癌细胞悬液于冰盘中待用。

1.2.2 造模分组、给药及取材：40只健康小鼠腋下接种瘤细胞悬液进行造模，小鼠腋下出现瘤体视为成功，从造模成功的小鼠中挑选24只，随机分为三组。替加氟片小鼠用药量计算：替加氟片成人用量为1000 mg/d(体重按60 kg计算)，则小鼠每日替加氟灌胃量应为1000 mg/60 kg×9.01×0.02 kg=3 mg。将替加氟片研磨至粉末，加蒸馏水配制成15 mg/ml的混悬液,灌胃0.2 ml/d。培元抗癌汤小鼠用药量计算：培元抗癌汤中各药物重量之和为138 g，小鼠每公斤体重用药量计算为：138 g/60 kg×9.01×0.02 kg=0.4 g，中药用药浓度为2 g/ml，灌胃0.2 ml/d。模型组：予0.9%氯化钠溶液0.2 ml/只,灌胃。替加氟组：予浓度为15 mg/ml替加氟溶液0.2 ml/只，灌胃。中西结合组：予浓度为4 g/ml中药汤剂0.1 ml/只，灌胃，浓度30 mg/ml替加氟溶液0.1 ml/只，灌胃。每日用药1次，连续用药14 d。用药后第15日，小鼠脱臼处死，在超净工作台上，解剖剥离小鼠腋下的瘤体，除去瘤体周围的组织，0.9%氯化钠溶液冲洗，并测量其大小、重量，计算抑瘤率。

1.2.3 观察各组小鼠一般情况：观察每组小鼠进食、饮水、毛色以及活动状况，测试其反应度，是否出现腹泻、消瘦或死亡等不良情况并做记录。

1.2.4 计算各组小鼠抑瘤率：小鼠全部脱臼处死后，取瘤组织称重并计算抑瘤率。抑瘤率=[(模型组平均瘤重-药物干预组平均瘤重)]/模型组平均瘤重×100%。

1.2.5 各组小鼠α-SMA、Vimentin、CXCL1、CXCL2、CXCL8蛋白表达检测：把少量瘤组织放于匀浆器球状部位，剪碎，加裂解液(含苯甲基磺酰氟)在匀浆器中进行匀浆，严格按照BCA蛋白定量测试盒说明书操作，测定蛋白质浓度。放入沸水中水浴10 min，冷却后在-20 ℃冰箱存放。以RIPA裂解液调整蛋白浓度，5×还原样品缓冲液滴加后调整样品终浓度2 mg/ml。配制好含有5%脱脂奶粉的TBST，将转膜完成的PVDF膜放入其中，室温，置于摇床上晃动2 h。加入稀释过的相应一抗，PVDF膜浸泡其中，4 ℃下孵育过夜，缓慢晃动。按照1∶50000的比例稀释相应的辣根过氧化物酶，用以标记二抗，PVDF膜浸泡其中，37 ℃下孵育2 h，缓慢晃动。TBST充分洗涤PVDF膜5～6次、5 min/次。配制好发光溶液并滴至PVDF膜上，用X线胶片压片，再加入显影液、定影液，最后冲洗胶片；扫描胶片，用Band Scan软件分析胶片灰度值，计算α-SMA、Vimentin、CXCL1、CXCL2、CXCL8蛋白表达量。

2 结 果

2.1 各组小鼠一般情况比较 干预后，模型组小鼠瘤体逐渐增大，进食、饮水量日益减少，毛色暗黄，对外界刺激反应逐渐下降，数只小鼠蜷缩在一起，活动明显减少。替加氟组与模型组小鼠比较，进食、饮水量明显增多，体重增加，可见腋下瘤体，但瘤体未明显增大，毛色正常，对于外界刺激反应相对灵敏。中西结合组小鼠进食、饮水状况良好，体重有所增加，腋下瘤体明显小于其他组，对外部刺激反应敏感，活动无明显异常。

2.2 各组小鼠瘤体重量及抑瘤率比较 见表1。替加氟组、中西结合组瘤体重量低于模型组，差异有统计学意义 (均P<0.05)；中西结合组瘤体重量低于替加氟组，差异有统计学意义(P<0.05)。中西结合组抑瘤率高于替加氟组(P<0.05)。

表1 各组小鼠瘤体重量及抑瘤率比较

2.3 各组小鼠α-SMA、Vimentin蛋白表达比较 替加氟组、中西结合组小鼠α-SMA、Vimentin蛋白表达低于模型组，差异有统计学意义(均P<0.05)；中西结合组较替加氟组的α-SMA、Vimentin蛋白表达低，差异有统计学意义(均P<0.05)。见表2(图1)。

表2 各组小鼠α-SMA、Vimentin蛋白表达比较

1：模型组；2：替加氟组；3：中西结合组

2.4 各组小鼠CXCL1、CXCL2、CXCL8蛋白表达比较 替加氟组、中西结合组小鼠CXCL1、CXCL2、CXCL8蛋白表达低于模型组，差异有统计学意义 (均P<0.05)。中西结合组的CXCL1、CXCL2、CXCL8蛋白表达较替加氟组低，差异有统计学意义(均P<0.05)。见表3(图2)。

表3 各组小鼠CXCL1、CXCL2、CXCL8蛋白表达比较

1：模型组；2：替加氟组；3：中西结合组

3 讨 论

目前，恶性肿瘤的发病率和病死率呈上升趋势，严重威胁人类健康，且我国属肝癌高发地区，年发病率和病死率均超过全球总数的50%[13-14]。中医认为肝癌的发生，受正气内虚、外感邪毒、内伤七情、饮食失宜等多重因素共同作用，导致脏腑气血运行失常、气滞痰凝血瘀，相互搏结，湿热久蕴，渐成肝积。培元抗癌汤由西洋参、郁金、黄芪、炒白术、莪术、白花蛇舌草、茯苓、厚朴等药物组成，全方以培元祛邪，标本兼治，诸药合用，祛邪而不伤正。CAFs是肿瘤微环境中参与肿瘤生长、转移最重要的细胞成分之一，CAFs既能直接刺激肿瘤细胞的生长，又能间接提高癌细胞的侵袭力，以上作用通过CAFs自身分泌的细胞因子、趋化因子、促炎介质等实现，在肿瘤形成阶段起重要作用。α-SMA起支撑细胞的作用，参与真核细胞微丝结构的形成，有研究证实肝癌的分化程度与α-SMA的表达有关[15]，恶性程度高的低分化肝癌中α-SMA表达最高。Vimentin作为细胞骨架蛋白之一，是一种特异性分布于间质细胞的中间丝蛋白，Vimentin和α-SMA为癌相关成纤维细胞的标志性蛋白，其表达与CAFs数量和活性程度相关。研究表明CAFs促进肿瘤细胞生长、血管生成，CXCL可促进其增殖、迁移[16]。研究发现不仅肝癌细胞可以分泌CXCL1，促进癌细胞侵袭，CXCL1在黑色素瘤、卵巢癌、结直肠癌、胃癌、乳腺癌、食管癌等多种恶性肿瘤生长和侵袭转移等方面起到决定性作用。另有研究证实 CXCL2对肝癌细胞生长、发展和侵袭转移起关键作用[17]。CXCL8是一个被广泛研究的细胞因子，它能加速内皮细胞的增殖和迁移，抑制内皮细胞凋亡，促进肿瘤血管生成，CXCL8高表达与肝癌的发生、侵袭和转移显著相关[18-19]。因此抑制CAFs及其分泌的CXCL1、CXCL2、CXCL8可起到抑制肿瘤的作用。近年来，不断有研究发现复方中药能通过调节CAFs治疗恶性肿瘤[20]。本实验研究发现，培元抗癌汤联合替加氟干预肝癌模型后，其小鼠一般状态较好，优于其他各组，提示中药在改善生存质量方面有优势，这与临床中医药治疗恶性肿瘤疗效相一致。各用药组移植瘤瘤体重量明显低于模型组，中西结合组可明显抑制瘤体生长，提示中药联合化疗在控制肿瘤生长方面要优于单纯化疗，这可能与干预肿瘤微环境有关。中西结合组可明显降低α-SMA、Vimentin、CXCL1、CXCL2、CXCL8蛋白的表达，提示中西医联合用药可能通过抑制α-SMA、Vimentin、CXCL1、CXCL2、CXCL8水平，达到抑制肿瘤生长的目的。