山慈菇-王不留行干预肺癌向骨转移过程生物信息学作用机制

刘文佳,刘宗凯,初晓苏,刘寨东

(1.山东中医药大学附属医院，山东 济南 250035；2.山东中医药大学，山东 济南 250035)

肺癌是临床发病率及病死率最高的恶性肿瘤之一，严重影响患者的身心健康，并给患者家庭及社会造成沉重的经济负担[1]。2014年的一项流行病学调查显示，我国新发肺癌病例78.1万，且同期病死率达80%[2]。肺癌患者初期往往没有特异性临床症状，57%的肺癌患者就诊时已经发生远处转移[3]。肺癌远处转移最常见的靶组织是骨骼，常引起病理性骨破坏、骨折、疼痛等[4]。因此，探究肺癌骨转移过程中存在的作用机制具有重要意义。

从近年研究报道来看，中药在治疗肿瘤方面的效果较好，多项研究证实中药能够有效影响肿瘤细胞的生长增殖、凋亡、侵袭及迁移[5]。中药山慈菇具有清热解毒、化痰散结功效，现代药理学证明山慈菇具有多种生物碱，有较强的抗癌活性[6]。有研究在统计1374次恶性肿瘤病案中发现，使用频次最高的是山慈菇，其使用频率为77.29 %[7]。王不留行具有活血消肿功效，与山慈菇同用表现出对多种肿瘤的抑制作用[8]。

中药往往是多靶点、多途径协同作用而发挥疗效，因此其机理较难诠释，网络药理学的整体性、系统性、动态性与中医整体观念吻合，因此近年有不少学者利用网络药理学的方法对中医药进行研究。本次通过网络药理学相关技术方法探讨山慈菇-王不留行这一药对在肺癌骨转移过程中的分子作用机制，以期为本病的治疗提供新的思路与方法。

1 资料与方法

1.1 疾病靶基因预测 以“肺癌”“骨转移瘤”作为关键词，采用疾病基因数据库(Database of gene-disease associations，Dis Ge NET)、人类基因数据库(Human gene database，Gene Cards)，人类孟德尔遗传综合数据库(Online mendelian inheritance in man，OMIM)，综合型药物数据库(Drug bank online，Drug Bank)以及治疗靶标数据库(Therapeutic target database，TTD)对疾病已知靶基因进行检索与筛选，合并各数据库的疾病靶基因，获得已明确的疾病靶点。

1.2 山慈菇-王不留行有效成分筛选及靶点预测 通过中药系统药理学技术平台(Traditional Chinese medicine systems pharmacology databaseand analysis platform，TCMSP)以山慈菇、王不留行为关键词检索其化学成分，并以口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)≥30%和类药性(Drug likeness，DL)≥0.18作为活性化合物的筛选条件，将具有较高活性的化合物筛选出来，将所得到的活性成分通过有机小分子生物活性数据库(Pub Chem)获得相对应的SMILES及2D结构。将所得结构导入Swiss Target Prediction及Drug Bank数据库对靶点进行预测，相似性阈值取为0.85，并把人类基因型作为筛查条件。导入蛋白质数据库(Unitprot)进行基因的标准化处理。利用Cytoscape 3.7.2软件，构建中药-有效成分-靶点网络图。

1.3 山慈菇-王不留行干预肺癌骨转移相关键靶基因筛选 将所筛选的山慈菇-王不留行潜在靶基因与肺癌及骨转移瘤靶基因交叉映射，得出山慈菇-王不留行干预肺癌骨转移过程中的映射靶基因，借助String构建出关键靶点PPI网络信息，根据节点连接度(Degree)值的大小进行筛选，得到核心靶基因，所获取的核心靶基因则是直接或间接调控肺癌骨转移过程的关键靶点，也就是山慈菇-王不留行干预肺癌骨转移过程的分子作用机制。

1.4 生物通路及富集分析 将筛选出的核心靶点导入基因功能注释数据库(Database for annotation,visualization and integrated discovery，DAVID)，进行京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路分析以及基因本体(Gene ontology，GO)生物过程的富集分析。以P≤0.05为筛选标准，分别将筛选出的前20个GO条目与KEGG条目借助Omic Share云平台绘制富集分析气泡图。

2 结 果

2.1 疾病靶基因预测 以“lung cancer”“metastatic tumor of bone”作为关键词，通过Dis Ge NET、Gene Cards、OMIM、Drug Bank以及TTD数据库对疾病已知靶基因进行检索与筛选，整合后共获得肺癌相关靶基因1097个，骨转移瘤相关靶基因569个。

2.2 山慈菇-王不留行有效成分筛选及靶点预测 以OB≥30%、DL≥0.18为筛选标准，在TCMSP数据库共检索到山慈菇-王不留行活性成分6个，其中槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇具有较高自由度，见表1。根据SMILES及2D结构预测出作用靶点116个，利用Cytoscape 3.7.2软件，构建其中药-有效成分-靶点网络图(图1)。

表1 山慈菇-王不留行活性成分

图1 中药-有效成分-靶点网络图

2.3 山慈菇-王不留行干预肺癌骨转移关键靶基因筛选 将所筛选的山慈菇-王不留行潜在116个靶基因与获取的疾病靶基因交叉映射，发现山慈菇-王不留行对肺癌骨转移的靶基因映射率为2.8%、映射出关键靶点35个，作为山慈菇-王不留行干预肺癌骨转移的直接或间接作用靶标基因，占据该药对作用靶点的30.2%左右。将这35个关键点导入String数据库，构建映射靶点PPI网络信息见表2，35个节点在0.4中置信度下有347条相互作用关系。根据Degree≥20进行筛选，得到核心靶点15个，利用Cytoscape 3.7.2软件构建核心靶点图(图2)。

图2 核心靶点图

表2 山慈菇-王不留行对肺癌骨转移映射的关键靶点

2.4 生物通路及富集分析 对“2.3”获得的15个核心靶点采用DAVID数据库进行GO生物过程和KEGG信号通路分析，得到生物过程147条、信号通路66条；以P≤0.05、错误发现率(false discovery rate，FDR)≤0.05为标准，取前20条以气泡图的形式展现出来(图3、4)。生物通路下靶基因见表3。

图3 前20条通路的GO生物过程气泡图

图4 前20条通路的KEGG分析气泡图

表3 生物通路下的靶基因

3 讨 论

中医学将肿瘤归为“癥瘕”“乳岩”等范畴，其病机多为气滞、痰凝、血瘀[9]。刘伟胜教授提出“正虚邪实，癌毒为患”的观点，认为正气亏虚是肺癌发生的基础，而癌毒是致病的直接因素[10]。肺癌病程较长，常导致患者正气亏损、元气衰败、伤津成毒、四散流溢。肺癌晚期患者多因肾气衰微，无以生髓养骨、骨失所养，则邪毒流窜于骨发生转移。癌毒瘀滞于骨，则痰瘀搏结、积聚成毒瘤，形成骨质破坏，而疼痛则是痰瘀阻滞所致。中医药在肺癌骨转移的治疗中，具有延长患者生存期、改善生存质量等优势[11]。

经本次网络药理学研究发现，山慈菇-王不留行中的槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇具有较高自由度，这可能是抑制肺癌骨转移的重要因素。有研究发现槲皮素能通过抑制Snail介导的上皮-间充质转化来抑制原位A549异种移植模型中非小细胞肺癌细胞系的迁移/侵袭和骨转移，并延长存活时间[12]。有研究表明β-谷甾醇能够抑制肺癌A549细胞的生长,通过调控其细胞周期引起细胞凋亡[13]。β-谷甾醇、豆甾醇均是植物甾醇的重要组成部分，植物固醇通过多种作用机制(包括抑制致癌物的产生、癌细胞的生长、血管生成、侵袭和转移、促进癌细胞的凋亡等)发挥抗癌作用[14]。另外，MnSOD能够诱导FoxM1表达并促进肺癌的侵袭迁移性，研究表明异牡荆黄素能够下调MnSOD、FoxM1的表达，抑制肺癌细胞的这种迁移能力[15]。对217例肺癌患者测序发现，TP53调节的基因与细胞迁移有关，推测是肺癌转移的关键驱动基因[16]。另有研究表明TP53可以促进肺癌细胞分泌A1AT，进一步诱导上皮细胞间质化，以驱动肺癌细胞侵袭和转移[17]。此外，P53通过上调CXCL5表达增强细胞迁移能力，选择性除去P53后则该能力下降[18]。同时TP54对骨骼具有较强亲和力，能够诱导成骨细胞成熟而发生骨转移[19]。相关肺癌细胞研究表明EGFR可以抑制OPG、上调RANKL刺激破骨细胞发生溶骨性骨转移，而抑制EGFR时这种骨吸收能力减弱[20]。此外，还有研究表明EGFR能够诱导VEGFA促进肿瘤血管生成，诱导肺癌骨转移过程[21]。VEGFA通过调控血管生成与通透性，增加肺癌侵袭转移作用，miR-1被认为是重要抑癌基因，研究表明miR-1可以下调VEGFA活性,抑制肺癌干细胞的转移和侵袭[22]。当C-jun被激活时会上调其蛋白表达,C-jun蛋白磷酸化能诱导肿瘤细胞的转化[23]。C-jun蛋白在多种肿瘤中呈高表达，参与肿瘤的形成和进展,还可促进肺癌的侵袭和转移[24]。MAPK广泛存在于细胞中参与细胞内外信息传导,调控细胞有丝分裂及炎症反应等，MAPK1是其下游靶标，调节机体的免疫反应[25]。此外，MAPK1也高表达于各种肿瘤中，研究表明通过下调MAPK1可以减弱非小细胞肺癌的细胞增殖、侵袭、迁移能力，并抑制上皮间质转化[26]。

TNF-α作为一种重要促炎因子，其表达增加能够促进破骨细胞形成。TNF-α一方面诱导破骨前体细胞分化为破骨细胞，另一方面通过调控相关因子促进破骨细胞活化。当肺癌细胞播散至骨微环境时会与骨衬细胞结合进入休眠期，而破骨细胞能够去除骨衬细胞重新激活肿瘤细胞，形成转移灶。此外OPG作为非典型的TNF受体之一,同样在肺癌骨转移中具有重要作用，OPG/RANKL/RANK轴在恶性肿瘤骨转移研究中具有重要地位。类风湿性关节炎是一种慢性免疫性疾病，有数据表明其合并肺癌的概率较高[27]，原因在于其相关免疫抑制治疗会引起TNF等促炎因子的表达，增加肺癌发生风险。有关实验通过小鼠模型证明了免疫抑制剂能够减弱NK细胞的增殖能力，促进癌症转移[28]。蛋白聚糖分布于细胞内外及细胞膜表面，具有多种生物功能，部分蛋白聚糖硫酸化程度降低可导致肿瘤细胞间粘连降低。多配体蛋白聚糖是其中一种，通过细胞内外信息交换诱导细胞生长、分化、黏附及迁移，而肿瘤细胞内合成的多配体蛋白聚糖2在肿瘤血管生成及侵袭迁移方面具有重要作用[29-30]。NOD样受体通路在免疫功能调节中的作用，已有研究证明其参与肺部的炎症损伤[31]，其中晚期高表达的NOD1、NOD2能够影响体内炎症水平，产生大量炎症因子，诱导肿瘤生长、侵袭及转移。此外NOD1还可以激活下游MAPK及NF-κB信号通路,调控体内炎症免疫反应、氧化应激、细胞增殖等过程，进一步诱导炎症因子调节破骨细胞干预肿瘤细胞增殖、转移。所以，山慈菇-王不留行可能通过TNF通路、类风湿性关节炎通路、癌症中蛋白聚糖通路、NOD样受体通路调节体内微环境水平调控肺癌骨转移进程。

肺癌骨转移是一个复杂过程，肿瘤细胞脱落随血液循环定植于骨组织并进入休眠，破骨细胞等通过相互作用重新激活肿瘤细胞，进而增殖转移。经网络药理学分析发现山慈菇-王不留行通过活性成分-靶点-通路作用于不同方面调控这一过程，一方面通过抑制体内血管生成构建及炎症因子的释放，改善体内氧化应激水平，抑制肿瘤的生长发育；另一方面干预破骨细胞等骨骼微环境下调对转移肿瘤细胞的激活能力，使其保持休眠状态。当然肿瘤细胞激活也与自身条件有关，需进一步实验研究探索。