透穴刺法对帕金森病焦虑大鼠杏仁核TNF-α和IL-10表达的影响

马振旺，梁 浩，赵 兵，蔡绍杰，郭 婧，于 丹

(1.黑龙江省中医药科学院南岗分院，黑龙江 哈尔滨 150006；2.黑龙江省中医药科学院，黑龙江 哈尔滨 150000)

帕金森病是常见的神经系统疾病，我国65岁以上人群的患病率约为1700/10万，至2030年我国帕金森病患者预计将增至494万，约占全世界帕金森病患者的50%[1-2]。既往认为该疾病主要表现为运动迟缓、肌强直等运动症状，近年研究显示其病理改变可累及周围神经系统和大脑皮质，从而引起焦虑等多种非运动障碍症状[3]。此类非运动障碍症状严重影响患者生活质量，且常规抗帕金森病药物难以起效[4]。焦虑是帕金森病非运动障碍的主要表现之一，这可能与神经递质异常、脑内炎症反应、杏仁核体积缩小等因素有关[5]。早在《黄帝内经》《中藏经》中已有中医治疗帕金森病相关记载，并将其归于“颤证”“郁证”“百合病”“脏躁”“不寐”等范畴。针灸的头穴透刺能够作用于大脑，改善脑部新陈代谢，促进脑功能重建[6]，有助于帕金森病焦虑的临床治疗，但目前仍欠缺循证学依据。本研究拟通过建立帕金森病动物模型探讨透刺疗法对帕金森病焦虑的疗效，并分析其对大鼠杏仁核肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor α,TNF-α)和白细胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：自哈尔滨医科大学实验动物学部购入健康雄性Wistar大鼠60只，3月龄，体重250～350 g，饲养于黑龙江省中医药科学院实验动物中心动物房(SPF级)，统一喂食由动物实验中心配制的鼠粮和水，实验前适应性饲养1周，动物室内相对湿度50%～70%、室温20～26 ℃、光照黑暗各12 h，自由摄食饮水，避免噪声、强光等不利条件。

1.1.2 主要试剂与仪器：盐酸6-羟基多巴(6-Hydrodopamine,6-OHDA)、阿扑吗啡(Apomorphine,APO)购自美国Sigma公司；山羊抗兔TNF-α多克隆抗体、大鼠IL-10单克隆抗体购自英国Abeam公司。旷场实验仪(型号OFT-100，成都泰盟科技有限公司)；高架十字迷宫(深圳瑞沃德公司)；脑立体定位仪(型号SN-2N，日本Narishige公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 建模、分组与给药：帕金森病模型制备：大鼠接受水合氯醛腹腔麻醉，头部固定于脑立体定位仪上，暴露头骨，依据Paxinos-watson大鼠脑定位图谱，确定左侧内侧前脑束位置，腹腔注射地昔帕明溶液5 mg/kg以保护去甲肾上腺素能神经元。30 min后，左侧内侧前脑束缓慢注射4 μl的6-OHDA，4 min内注射完毕，玻璃微电极在注射部位停留5～10 min，消毒、缝合伤口。所有大鼠术后均注射8万U青霉素钠抗感染。手术第14天后，皮下注射0.05 mg/kg的APO 诱发旋转实验，如果5 min内大鼠向右侧旋转>20圈，提示帕金森病大鼠造模成功。帕金森病焦虑模型制备：造模成功的大鼠随机分成正常组、模型组、黛力新组、透穴刺法组各15只。正常组大鼠不接受任何刺激，正常饲养。模型组大鼠单笼饲养，每日随机接受昼夜颠倒、禁食、禁水、冷水游泳、夹尾、潮湿环境、束缚其中一种刺激造模处理。黛力新组在模型组大鼠干预的基础上，在每日应激刺激前接受黛力新(国药准字H20153122)灌胃。黛力新给药方法：将黛力新溶于纯净水中，按照1.8 mg/kg剂量每日上午9：00～12：00灌胃给药，1次/d。透穴刺法组在模型组大鼠干预的基础上，在每日应激刺激前接受透穴刺干预，根据《实验针灸学》和《中国兽医针灸学》进行穴位定位，每日上午9：00～12：00采用0.35 mm×25 mm的针灸针自百会穴呈15°向太阳穴方向递进透刺，行捻转手法，200 r/min，每次行针2 min，1次/d。每组均连续干预14 d。

1.2.2 行为学检测：各组大鼠干预结束后第2天上午9：00～12：00进行行为学检测。①旷场实验：将大鼠置入旷场，记录5 min内大鼠在旷场中的穿格数(Number of squares crossed,NSC)和直立次数(Number of rearing,NR)，并记录在中央区停留时间百分比(Residence time distribution in center，RTDC)。RTDC=(中央区停留时间/总观察时间)×100%。NSC、NR主要反映大鼠运动能力，RTDC下降则与焦虑行为发生有关。②高架十字迷宫实验：将大鼠置于中央区，面向任意一个开放臂，记录其在5 min内进入开放臂和闭合臂的次数及停留时间，计算进入开放臂次数的百分比(Percentage of access the open arms,PAOA)、开放臂停留时间百分比(Residence time distribution in the open arms,RTDOA)。PAOA=开放臂进入次数/(开放臂进入次数+闭合臂进入次数)×100%；RTDOA=开放臂停留时间/(开放臂停留时间+闭合臂停留时间)×100%。PAOA、RTDOA下降与焦虑行为发生有关。每次实验结束后，喷洒200 ml/L乙醇祛除实验设备中的残留气味。

1.2.3 蛋白免疫印迹(Western blot)实验：行为学实验结束后，腹腔注射600 mg/kg水合氯醛深度麻醉，随后快速心脏灌注150 ml浓度为0.01 mol/L的PBS溶液，予250 ml的40 g/L多聚甲醛固定。断头，剥离脑组织并固定4 h，随后将脑组织转移至300 g/L蔗糖溶液中，直至脑组织沉底。切取大鼠新鲜杏仁核组织，提取蛋白，使用BCA法测定蛋白浓度。SDS-PAGE电泳、转膜、封闭后，一抗4 ℃过夜，二抗常温孵育2 h。随后显影、定影、拍照，分析IL-10和TNF-α、β-actin各曝光条带面积和灰度的乘积，计算各指标与β-actin的比值。

2 结 果

2.1 各大鼠NSC、NR、RTDC比较 见表1。各组大鼠NSC、NR比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。模型组RTDC明显低于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；黛力新组、透穴刺法组RTDC高于模型组；且透穴刺法组RTDC高于黛力新组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 各大鼠NSC、NR、RTDC比较

2.2 各大鼠PAOA、RTDOA比较 见表2。透穴刺法组PAOA高于正常组、模型组和黛力新组，差异有统计学意义(均P<0.05)。模型组RTDOA低于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)，黛力新组、透穴刺法组RTDOA高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)，且透穴刺法组RTDOA高于黛力新组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 各大鼠PAOA、RTDOA比较(%)

2.3 各组大鼠TNF-α、IL-10水平比较 见表3(图1、2)。模型组大鼠TNF-α高于正常组，IL-10低于正常组，差异有统计学意义(均P<0.05)。黛力新组、透穴刺法组TNF-α水平低于模型组，差异有统计学意义(均P<0.05)。透穴刺法组IL-10水平高于模型组、黛力新组，差异有统计学意义(均P<0.05)。

表3 各组大鼠TNF-α、IL-10水平比较(pg/ml)

图1 各组大鼠TNF-α蛋白表达

图2 各组大鼠IL-10蛋白表达

3 讨 论

帕金森病是一种中枢神经系统退行性疾病，焦虑是其常见的非运动系统症状之一，采取可靠方案缓解焦虑，有助于改善患者生活质量，提升帕金森病治疗效果[7-8]。杏仁核是脑内边缘系统重要器官，在学习记忆、情绪及行为调控等方面发挥着重要作用，研究显示帕金森病进展期间杏仁核可能出现神经元形态改变[9]，因此推测其与患者焦虑等症状有关，故本研究以杏仁核为研究对象，探讨透穴刺法对帕金森病焦虑大鼠杏仁核TNF-α及IL-10水平的影响。

采用6-OHDA损毁单侧内侧前脑束是帕金森病大鼠的有效造模方案[10-11]，但所制备的帕金森病大鼠模型是否能够表现出类似于人类的焦虑样行为，目前仍有一定争议。刘椰等[12]研究显示采用上述方案制备的帕金森病模型呈现出一定的焦虑样行为，但Carvalho等[13]报道指出上述方案制备的帕金森病模型虽然有一定抑郁表现，但欠缺焦虑表现。为规避这一问题，本研究在6-OHDA处理的基础上，进一步通过每日应激刺激诱导焦虑行为，通过旷场实验发现，每日应激不会影响帕金森病大鼠的运动能力，但会导致其RTDC下降，高架十字迷宫实验也显示每日应激会导致大鼠RTDOA降低，这均说明其表现出焦虑行为，与既往报道[14]结论相符。

本研究结果提示透穴刺法能够有效改善帕金森病焦虑大鼠的焦虑症状，且这种焦虑改善效果优于常见抗焦虑药物黛力新，这与既往针对焦虑治疗的报道结论相一致[15-16]。从中医理论角度而言，这可能是因为透穴刺法作用于百会穴等百脉汇聚之处，能够通调阴阳，连贯全身经穴，调节机体阴阳平衡，还可疏肝理气，平肝潜阳，调畅情志[17]。另一方面，现代神经生理研究也证实，针刺百会穴可以直接兴奋上行的激活系统，改善大脑细胞新陈代谢、增强脑活力、提高脑氧含量，从而促进脑功能重建，减轻焦虑样行为。吴成举等[18]研究也表明类似的针刺疗法能够促进帕金森病大鼠的脑组织功能恢复。

本研究进一步发现，帕金森病焦虑的形成可能与脑组织炎症反应有关。脑组织炎症反应可能损伤神经元，加速细胞外β-淀粉样蛋白的产生，从而促进帕金森病的发展，并诱发焦虑等非运动系统症状，这与张楠等[19]实验结论相符。本研究中，相较于模型组，透穴刺法组TNF-α表达水平下降，IL-10表达水平升高，说明透穴刺法能够减轻脑组织炎症反应，赵鹏等[20]对120例脑卒中患者的随机对照研究也显示，针刺疗法有助于改善患者全身炎症反应。