补肺健脾益肾方对COPD模型大鼠TLR4/MyD88/NF-κB通路相关因子的影响

文小竹，谭光波，朴金安(韩国)

(湖南中医药大学研究生院，湖南 长沙 410208)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是呼吸系统的常见病，具有病程长、反复发作的特点，其对肺功能及肺组织造成不可逆的损伤，并给患者及其家庭带来沉重负担[1-2]。COPD病因和发病机制目前并未完全阐明，被认为可能与吸烟、生物燃料、空气污染、遗传等因素有关，慢性炎症是其发病机制中的重要环节[3]。Toll样受体4(Toll like receptor 4，TLR4)/髓样分化因子88(Myeloid differentiation factor 88，MyD88)/核转录因子κB(Nuclear transcription factor-κB,NF-κB)作为炎症反应的经典通路，在COPD发病机制中发挥重要作用[4]。近年来中医药在改善COPD患者耐受性及生活质量方面取得一定效果并受到广泛关注，但鲜有TLR4/MyD88/NF-κB通路相关的研究[5]。本研究对COPD大鼠模型进行不同干预，以TLR4/MyD88/NF-κB通路为切入点，探讨补肺健脾益肾方改善COPD的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：清洁级Wistar大鼠40只，雌雄各20只，6～8周龄，体重150～210 g，平均(182.14±15.64)g，均饲养于湖南中医药大学动物实验中心，且未限制每日进水、进食，室温控制在20～24 ℃，湿度为50%，按照动物日节律调节光照，适应性饲养1周后进行实验。

1.1.2 主要仪器与试剂：病理组织包埋机(BM-Ⅱ型，安徽电子科学研究所)、切片机(AO型，德国Leica公司)、显微摄像仪(20486型，日本Olympus公司)、实时荧光定量仪(CFX384Touch型，美国Bio-Rad公司)、离心机(LDZ5-2型，北京京立离心机有限公司)、双光束紫外可见分光光度计(TU-1901型，北京普析通用仪器有限责任公司)、超低温冷冻柜(ULT-1386-3型，美国Revco Value公司)，TLR4、MyD88、NF-κB抗体均购自CST公司。

1.2 实验方法

1.2.1 补肺健脾益肾方：黄芪30 g，党参、茯苓、熟地黄各20 g，白术、丹参各15 g，防风、淫羊藿、紫河车、山茱萸、陈皮、法半夏各10 g。以水煎煮2次，过滤后浓缩为1.25 g/ml药液。

1.2.2 模型的建立与分组：采用随机数字表法将40只大鼠随机分为模型组、常规组、实验组、正常组，每组10只。除正常组外，其余组参照周凤等[6]实验研究采用亚硝胺烟雾暴露加脂多糖气管滴注方案建立COPD大鼠模型。具体方法为：予气管内脂多糖滴注，剂量为2 ml/kg，1次/周，持续6周，其余时间则每天同一时间将大鼠放置于自制有机透明储物箱内，使其暴露于亚硝胺烟雾内(将点燃的亚硝胺通过悬挂使其烟雾注入自制箱)，每次暴露时间为0.5 h，持续6周；正常组则采用等剂量0.9%氯化钠溶液进行气管滴注，且在自制箱内注入正常空气。各组滴注剂量、频率相同。

1.2.3 给药：自第7周开始正常组及模型组予0.9%氯化钠溶液5 ml/(kg·d)滴灌入胃，常规组予孟鲁司特钠混悬液1 mg/(kg·d)滴灌入胃，实验组在常规组基础上予补肺健脾益肾方6.25 g/(kg·d)滴灌入胃，各组均连续给药6周。

1.2.4 取材：给药结束后第1 天通过动脉放血法处死所有大鼠，在大鼠颈部做一切口并进行逐层分离，打开胸腔充分显示双肺，止血钳夹闭右肺门后在气管软骨间作一切口并采用0.9%氯化钠溶液反复灌洗，3次注入灌洗液共6 ml，收集灌洗液，离心，置于-80 ℃冰箱保存；取右肺标本浸泡于4%多聚甲醛缓冲液。

1.2.5 一般情况观察：监测各组大鼠皮毛、呼吸、活动、饮食、体重变化等情况，大鼠测量体重频率为2次/周；记录各组大鼠死亡情况，并分析其原因。

1.2.6 PCR检测TLR4 mRNA、MyD88 mRNA、NF-κB mRNA水平：采取实时荧光定量法(PCR)测量TLR4 mRNA、MyD88 mRNA、NF-κB mRNA表达。取出约100 mg组织用匀浆器匀浆后离心，提取溶液mRNA进行逆转录，然后进行PCR扩增，将扩增产物加入1%琼脂糖凝胶电泳，采用计算机分析目的电泳条带，实验结果采用两者积分吸光度的比值表示。TLR4引物：上游引物 5’-AGGGTTTCCTGTCAGTATCAAGTTT-3’，下游引物5’-TGATGCCTCCCTGGCTCCT-3’，片段长度140 bp；MyD88引物：上游引物 5’-TATACCAACCCTTGCACCAAGTC-3’，下游引物5’- CAGGCTCCAAGTCAGCTCATC-3’，片段长度134 bp；NF-κB引物：上游引物5’-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3’，下游引物5’-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3’，片段长度153 bp。内参Gapdh引物：上游引物5’-AGGCCGGTGCTGAGTATGTC-3’，下游引物 5’-TGCCTGCTTCACCACCTTCT-3’，片段长度122 bp。

1.2.7 肺组织形态学评分[7]：低倍光镜下观察肺组织进行形态学评分，该评分包括上皮细胞变性坏死糜烂脱落、气道管壁黏膜充血水肿、气道管壁中性粒细胞浸润，每个指标均采取Ⅰ-Ⅵ级评分，分数越高表明该项指标炎症发生情况越严重。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般情况比较 模型组大鼠干预期间毛发逐渐枯黄无光泽、倦怠少动、小便量增多、饮食减少，且分别于第5周、第8周各死亡1只，经解剖考虑肺气肿合并肺部感染所致。常规组和实验组精神略显疲乏，但其活动量、进食量明显优于模型组，常规组在治疗第6周死亡1只，经解剖考虑肺气肿合并肺脓肿所致；正常组大鼠干预期间皮毛光亮，活动无明显减少，饮水进食均正常，体重呈正常增长趋势。

2.2 各组大鼠TLR4 mRNA、MyD88 mRNA、NF-κB mRNA表达比较 见表1(图1、2)。与正常组比较，模型组大鼠TLR4 mRNA、MyD88 mRNA、NF-κB mRNA水平均高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，常规组、实验组以上指标均低，且实验组低于常规组，差异有统计学意义(均P<0.05)。

表1 各组大鼠TLR4 mRNA、MyD88 mRNA、NF-κB mRNA表达比较

2.3 各组大鼠肺组织评分比较 见表2。与正常组比较，模型组大鼠肺组织上皮细胞变性坏死糜烂脱落、气道管壁黏膜充血水肿、气道管壁中性粒细胞浸润评分均升高，差异有统计学意义(均P<0.05)。与模型组比较，常规组、实验组以上指标均低，且实验组低于常规组，差异有统计学意义(均P<0.05)。

A：模型组；B：常规组；C：实验组；D：正常组

A：模型组；B：常规组；C：实验组；D：正常组

表2 各组大鼠肺组织评分比较(分)

3 讨 论

中医并无COPD病名，根据其临床表现可将其归入“咳喘”“肺胀”范畴，其主要病机为本虚标实，病情复杂多变、缠绵难愈，病位在肺，后期可涉及脾、肾、心[8-9]。“气根于肾，肺气虚耗，母病及子，肾失摄纳”，肺、脾、肾三脏失常引起气短、呼多吸少[10]。补肺健脾益肾方益气扶正、疏风散邪，共同发挥补肺健脾益肾之效，本研究采用补肾健脾益肾方干预COPD模型大鼠，探讨其治疗COPD的可能作用机制[11]。COPD作为一种慢性消耗性疾病， “肺病久伤脾，子病及母，脾胃失于健运，不能生化水谷”致使脾肺亏虚，导致患者营养代谢异常、体重下降等[12-13]。补肺健脾益肾方通过调补肺肾，补卫表之气提中焦之气，滋肺化源，气机通利，无惧邪扰，肺肾同治，气阴双调，咳喘俱消[14]。

本研究结果显示，药物干预后，实验组、常规组大鼠TLR4 mRNA、MyD88 mRNA、NF-κB mRNA水平均低于模型组，实验组、常规组大鼠气道内炎症反应受到抑制，气道黏膜水肿得到缓解，气道内黏液分泌减少从而改善气道壁炎性浸润，气流受限程度减轻，故其活动度、进食量、烦躁程度等均得到明显恢复，且实验组改善程度优于常规组[15]。表明补肺健脾益肾方通过改善模型大鼠TLR4/MyD88/NF-κB通路改善COPD肺部症状，防止COPD进展。TLR4主要在抗原呈递细胞及部分实质细胞内表达，在中枢神经系统主要分布在小胶质细胞和神经元表面，可在一系列反应下介导MyD88，募集到受体细胞内后激活白介素相关激酶，磷酸化后与肿瘤坏死因子受体相关因子6结合，激活NF-κB并暴露核定位信号，使得NF-κB活化并进入细胞核启动转录从而诱导产生肿瘤坏死因子α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12，促进外周炎性细胞向气道组织移动、黏附和浸润，加重组织损伤[16]。TLR4/MyD88/NF-κB作为慢性炎症机制关键环节，在COPD的形成过程中发挥不可忽视的作用，本研究中补肺健脾益肾方可能通过TLR4/MyD88/NF-κB通路减轻气道慢性炎症反应和肺壁破坏，实现对COPD模型大鼠的治疗[17]。这与秦燕勤等[18]关于补肺益肾方对COPD模型兔炎症因子改善效果的研究结果一致。

补肺健脾益肾方重用黄芪补气升阳、益卫固表，可“补诸虚”“益元气”“壮脾胃”，经现代药理学证实其可松弛平滑肌，扩张心、肺血管，改善缺氧，与党参同用益气健脾，和熟地黄、淫羊藿等合用有补肾助阳之效，共为君药；白术、茯苓健脾化湿，山茱萸补肾涩精，与紫河车同用有益气养血之效，共为臣药；法半夏、陈皮燥湿化痰，防风解表散寒，丹参活血化瘀，四者共为佐使；全方扶正益气、化痰活血，共奏补肺健脾益肾之效、降气散瘀之功[19-20]。

综上，在孟鲁司特钠基础上使用补肺健脾益肾方，可通过抑制模型大鼠TLR4/MyD88/NF-κB通路改善肺组织炎症状态，从而延缓或阻止COPD的炎症进程。