基于网络药理学探究丹参对血小板聚集的机制

霍 苏，崔鹤蓉，顾昱昊，戴子琦，王亚欣，娄邵岩，戚 蕊，项嘉伟，王鹏龙，马 涛，雷海民

(北京中医药大学中药学院，北京 102488)

血小板聚集是指血小板具有相互黏附的特性，血小板膜上的糖蛋白黏附在纤维蛋白原，纤维蛋白原再黏附在另一侧的血小板上，通过纤维蛋白原血小板就互相聚集在一起[1]。血小板聚集性增高，是由于血管内皮细胞受损，引起了血小板活化、黏附、聚集，血小板聚集率高会引起血液黏稠，导致血管堵塞，形成血栓，而血栓的形成是动脉粥样硬化、急性心肌梗死、脑血栓等心血管疾病主要的发病机制。对于原发性血小板聚集率升高性疾病，临床上常用抗血小板聚集药物如环氧合酶抑制剂阿司匹林、糖蛋白Ⅱb/Ⅲa (GPⅡb/Ⅲa)抑制剂ReoPro和P2Y12抑制剂氯吡格雷，治疗心血管疾病[2]效果显著。然而，考虑到耐药的高频率和对患者的胃肠道不良反应，不建议长期使用这些药物。此外，长期使用多种抗血小板药物可能会增加毒性。在此基础上，需要开发新的抗血小板药物，以提高疗效和减少不良反应。目前，越来越多的研究发现，天然来源的新的活性物质以及植物中的某些化学物质具有很强的抗血小板聚集作用。

丹参是我国传统的活血化瘀中药之一，疗效显著，不良反应报道较少[3-4]。现代药理学研究表明，丹参具有增加冠状动脉流量、改善微循环、抗血小板聚集等多种药理作用[5-11]。临床研究表明，对不稳定型心绞痛、心肌梗死、短暂性脑缺血发作、动脉粥样硬化等心血管疾病的治疗和预防具有重要意义。丹参含有多种化学成分，主要分为两大类:一是二萜醌类的脂溶性成分，以丹参酮类二萜为主，如丹参酮类和隐丹参酮类；二是酚酸的水溶性成分，如丹参素、丹参酚酸类化合物。本文主要通过网络药理学研究丹参抑制血小板聚集的作用机制。

网络药理学[12-13]是基于系统生物学理论，结合药理学和计算机技术，实现药物作用的综合网络分析，特别适合对具有多组分、多靶点、多机制特征的中药进行研究。据此，本研究拟通过网络药理学方法筛选出丹参抗血小板聚集的潜在有效成分及其作用靶点，对其机制进行分析，为丹参临床应用提供科学依据。

1 资料与方法

1.1丹参活性成分筛选及其靶点的获取 通过TCMSP(http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)对中药中化学成分的吸收、分布、代谢进行预测。在 TCMSP 数据库检索“丹参”，共收集到202种化合物，再通过口服生物利用度(OB)和药物相似性(DL)对化合物的药物动力学进行筛选，其中，OB是指药物经口服给药后被机体吸收进入血液循环的相对量和速率；DL反映化合物中的特定功能基团与已知药物的相似性，二者对中药化学成分活性的评估具有重要意义。本研究根据以往研究，以OB≥30%，DL≥0.18作为筛选高活性关键化合物的阈值。

1.2丹参有效成分靶点规范 由于丹参有效成分靶点来源不统一造成丹参靶点名称不规范，因此需要对筛选得到的靶蛋白和基因信息进行校正。将所有的靶点在Uniport(http://www.uniprot.org/)数据库中进行搜索，将物种设置为人，获得靶点标准的Uniport名称。

1.3疾病靶点的获取与交集靶点的筛选 在GeneCards(https://www.genecards.org/)数据库输入关键词“Platelet aggregation”获得血小板聚集的蛋白靶点基因并与1.1筛选出的药物靶点进行韦恩分析，获取交集靶点。

1.4“药物-疾病-靶点”交互网路建立 为了阐述丹参治疗血小板聚集的有效机制，将丹参与肝纤维化的共同靶点与关键化合物的关系使用Cytoscape 3.7.2 软件进行绘制，在网络图中，关键化合物和靶点以节点表示，节点之间相互作用的关系以边来表示。

1.5蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络建立 考虑到靶点之间的相互作用对关联靶点进行相互作用分析，将丹参-肝纤维化共有的89个靶点基因导入String(https://string-db.org/cgi/input.pl) 数据库平台，研究物种选择人类，获取蛋白质相互作用关系，并筛选评分≥0.9 的蛋白关系，隐藏离散点，蓝色连线表示基因共进化证据，红色连线表示基因融合证据，黄色连线表示文本挖掘证据等，下载 PPI网络图，并筛选排名前30的PPI网络核心基因。

1.6基因本体(GO)富集分析 将药物疾病共有靶点进行GO的生物过程(BP)、分子功能(MF)、细胞组分(CC)富集，引用String数据库，将校正P≤0.05的项目进行筛选。使用R 3.6.3软件，安装并引用clusterProfiler，enrichplot，ggplot2包，绘制柱状图和气泡图。

1.7京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析 将药物疾病共有靶点进行KEGG通路富集分析，引用String数据库，将校正值P≤0.05的项目进行筛选。使用R 3.6.3，安装并引用ClusterProfiler包后，绘制柱状图和气泡图。

1.8分子对接 丹参中的潜在药效成分和关键作用靶点的3D结构分别从Pubchem数据库和PDB数据库(https://www.rcsb.org/)中下载。使用AutoDockTools1.5.6对潜在药效成分和关键作用靶点的3D结构进行去水、加氢，转换成Pdbqt格式。由Autodock Vina 1.1.2软件完成分子对接分析。最后利用PyMol 1.8对蛋白与分子结合的结果进行可视化处理。

2 结果

2.1药物化学成分及药物靶点筛选 利用TCMSP对丹参中的202种已知成分进行筛选，通过OB≥30%和DL≥0.18筛选出丹参中65种高活性关键化合物，包括丹参酮、紫杉醇、丹参醛、丹酚等。见表1。其中65种有效成分对应935个相关靶点，有680个有效相关靶蛋白和109个靶基因。

表1 丹参的活性成分信息

2.2疾病靶点 通过TCMSP数据库查询上述65种关键化合物的靶点信息，通过Uniprot进行基因ID的注释得到丹参中基因ID。在GeneCard中获取血小板聚集相关靶点5 394个，将药物与疾病的靶点基因导入 Excel，映射得到丹参-血小板聚集的共同靶点，见表2。并通过 R 语言绘制韦恩图，药物与疾病共有靶点84个，注释基因82个。

表1(续) 丹参的活性成分信息

表2 丹参-血小板聚集共有靶点

2.3“中药-成分-靶点-疾病”网络关系 将上述筛选获得的药物活性成分、潜在治疗靶点基因、药物、疾病名称导入Cytoscape 3.7.2软件，设置节点与边线将其相互关系绘制成可视化“中药-成分-靶点-疾病”网络图，见图1。由图1可知，网络共涉及节点135个，其中网络图中黄色部分为中药成分靶点，蓝色菱形为中药成分，紫色矩形为中药即丹参，红色为作用机制即血小板聚集。边线表示化合物、靶点、药物、疾病之间存在相关性。通过插件cytoNCA按照度和紧密度2种属性分别取排序靠前的成分或靶点。成分有：二氢丹参内酯；异隐丹参酮；丹参醌新酮Ⅰ；1，2，5，6-四氢丹参酮和丹参螺缩酮内酯等。靶点有β2肾上腺素能受体(ADRB2)、人类重组蛋白(OPRM1)、前列腺素内过氧化物合成酶2(PTGS2)、前列腺素内过氧化物合成酶1 (PTGS1)、碳酸酐酶Ⅱ(CA2)、乙酰胆碱受体亚型3(CHRM3)和丝裂原激活蛋白激酶14(MAPK14)等。

图1 “中药-成分-靶点-疾病”网络图

2.4PPI网络构建 将潜在治疗靶点基因导入String数据库平台，研究物种选择人类，筛选评分>0.9的蛋白关系，并完成PPI网络图，见图2。由图2可知，该网络包含270条边，71个节点。其中评分≥0.99的相互作用蛋白为：丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶-核内癌基因(AKT1-GSK3B)、重组蛋白-核蛋白转录因子(JUN-FOS)、内皮素 1(EDN1)、重组蛋白-内皮素受体A型基因(EDN1-EDNRA)、依赖蛋白激酶抑制剂1-细胞周期素D1(CDKN1A-CCND1)、依赖蛋白激酶抑制剂1-肿瘤抑制基因(CDKN1A-TP53)、依赖蛋白激酶抑制剂1-增殖细胞抗原(CDKN1A-PCNA)、肿瘤抑制基因-鼠双微染色体2(TP53-MDM2)、依赖蛋白激酶抑制剂-细胞周期蛋白依赖激酶2(CDKN1A-CCNA2)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1-内皮型一氧化氮合酶(AKT1-NOS3)、蛋白酪氨酸磷酸酶1-胰岛素受体(PTPN1-INSR)、细胞周期蛋白依赖激酶2-细胞周期蛋白B1(CCNA2-CCNB1)、表皮生长因子受体-信号传导与转录激活因子3(EGFR-STAT3)、白细胞介素6-信号传导与转录激活因子-3(IL-6-STAT3)、白细胞介素10-肿瘤坏死因子(IL-10-TNF)、白细胞介素10-白细胞介素6(IL-10-IL-6)、核蛋白类调控基因-细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子1C(MYC-CDKN1A)、白细胞介素6-白细胞介素4(IL-6-IL-4)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1-细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子1A(AKT1-CDKN1A)、重组蛋白-丝裂原活化蛋白激酶14(JUN-MAPK14)、白细胞介素10-信号传导与转录激活因子-3(IL-10-STAT3)、酪氨酸激酶受体-信号传导与转录激活因子-3(VEGFA-STAT3)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1-信号传导与转录激活因子-3(AKT1-STAT3)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1-胱天蛋白酶9(AKT1-CASP9)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1-肿瘤抑制基因(AKT1-TP53)、细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子1A-细胞周期蛋白B1(CDKN1A-CCNB1)、酪氨酸激酶受体-内皮型一氧化氮合酶(VEGFA-NOS3)、信号传导与转录激活因子(STAT3-CCND1)、肿瘤坏死因子-核因子κB抑制蛋白α抗体(TNF-NFKBIA)、核蛋白类调控基因-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(MYC-AKT1)、核蛋白类调控基因-重组蛋白(MYC-JUN)、肿瘤坏死因子-白细胞介素4(TNF-IL-4)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1-鼠双微染色体(AKT1-MDM2)、肿瘤抑制基因(JUN-TP53)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1-雌激素受体1(AKT1-ESR1)、细胞周期蛋白A2-肿瘤抑制基因(CCNA2-TP53)、丝氨酸/苏氨酸激酶-细胞周期蛋白D1(GSK3B-CCND1)、核内癌基因-信号传导与转录激活因子-3(MYC-STAT3)、雌激素受体1-细胞周期蛋白D1 (ESR1-CCND1)、肿瘤抑制基因-丝裂原活化蛋白激酶14(TP53-MAPK14)。这些蛋白之间的相互作用在网络中非常重要。通过计算每个基因的连接节点数量，找出前25个PPI核心，即：丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)、信号传导与转录激活因子-3(STAT3)、肿瘤抑制基因(TP53)、丝裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)、肿瘤坏死因子(TNF)、人内皮素1(EDN1)、白细胞介素6(IL-6)、细胞周期蛋白D1 (CCND1)、表皮生长因子受体(EGFR)、雌激素受体(ESR1)、酪氨酸激酶受体(VEGFA)、细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子1A(CDKN1A)、白细胞介素4(IL-4)、糖皮质激素受体(NR3C1)、毒蕈碱型乙酰胆碱受体M2(CHRM2)、内皮素受体A型基因(EDNRA)、白细胞介素2(IL-2)、雄激素受体(AR)、半胱天冬蛋白酶(CASP3)、5羟色胺受体2A(HTR2A)、阿片样物质受体(OPRD1)、阿片受体(OPRM1)、α1A肾上腺素能受体(ADRA1A)和α1D肾上腺素能受体(ADRA1D)、肾上腺素能受体基因(ADRA2A)。

图2 丹参潜在治疗靶点的PPI网络

2.5GO富集分析结果 将药物疾病共有靶点进行GO 的BP、MF、CC富集，引用String数据库，将校正P≤0.05的项目进行筛选，共富集到1 789条BP，113项分子功能相关，61项细胞组成相关。根据P值由小到大筛选排名前10的结果。富集得到的BP包括对氧水平的反应，肌肉细胞增殖与血管管径调节等，见表3。富集共有靶点最多的MF为G蛋白偶联胺受体活性，见表4。CC富集分析发现，靶蛋白主要分布在细胞膜和突触等，其中以细胞膜膜筏、膜微结构域、膜区域上的靶蛋白数量最多，见表5。

表3 药物疾病共有靶点的BP分析

2.6KEGG通路富集 将药物疾病共有靶点进行KEGG通路富集分析，引用String数据库，将校正P值≤0.05的项目进行筛选，共富集到129条信号通路，根据P值由小到大筛选排名前20的通路绘制见表6。由表6可知，经分析得到血管收缩、循环系统血管功能、血管大小调节、血管直径调节和平滑肌细胞增殖这5条信号通路是血小板聚集作用机制的主要通路。

表6 药物疾病共有靶点的生物信号通路

2.7分子对接分析 在分子对接中，配体与受体结合能的构象越稳定能量越低，自发结合作用的可能性越大。对丹参抗血小板聚集的潜在药效成分丹参酮ⅡA和关键作用靶点G蛋白偶联受体(GPCRs)进行分子对接分析。首先从Pubchem数据库和PDB数据库获取丹参酮ⅡA和丹参素的3D结构和GPCRs的晶体结构。GPCRs的晶体结构PDB号为2Y01，配体为Y01；PDB号为2Y03，配体为5fw。将潜在药效成分丹参酮ⅡA和关键作用靶点GPCRs的3D结构加氢去水去配体，再由Autodock Vina 1.1.2软件对其进行批量分子对接分析，分子对接结果显示，丹参酮ⅡA和丹参素对GPCRs有较好的亲和力，其中丹参素与GPCRs有较明显的氢键作用，结果见图3。

图3 分子对接图

3 讨论

血小板聚集性增加是血栓性疾病的主要病理机制，因此抑制血小板激活、抗血小板聚集，在血栓性疾病的防治过程中具有重要意义[1，7-9]。近年来研究表明，丹参具有改善微循环、抗血小板聚集、抗凝血、抗血小板活性等药理活性，现已从丹参中分离出100余种成分，主要包括脂溶性成分、水溶性成分和黄酮类成分，如丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、异隐丹参酮、丹酚酸、木犀草素等。本研究运用网络药理学方法，先通过OB和DL筛选得到丹参活性成分；再通过活性成分靶点与血小板聚集关联度预测丹参的血小板聚集作用机制的有效成分；最后分析有效成分与疾病的共有靶点所影响的BP和涉及的信号通路。从信号通路角度探讨丹参的血小板聚集作用的可能机制。

通过PPI筛选发现STAT3、IL-6、EGFR、ESR1、VEGFA、FOS、CDKN1A、IL-4、NR3C1、CHRM2、EDNRA、IL-2、AR、CASP3、HTR2A、HTR2C、OPRD1、OPRM1、ADRA1A、ADRA1D和ADRA2A等是丹参血小板聚集作用的关键靶点。丝裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)[14]是一组能被不同的细胞刺激激活的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。临床上发现抑制MAPK14激活可缓解缺血性心衰急性损伤，具有保护心肌的作用，从而抑制血小板聚集，抑制血栓的形成。因此推测丹参通过调节受损心肌细胞生长周期的作用，调节心肌细胞凋亡。本研究发现，丹参酮ⅡA、隐丹参酮等可直接作用于该靶点发挥抑制血小板聚集的作用。IL-6是一种由单核巨噬细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞和辅助型T细胞2(Th2)产生的多功能的炎症细胞因子，目前认为其参与血小板聚集机制可能有3种[15]:(1)能够激活血小板，增加其促凝活性促进血小板聚集:(2)能够诱导肝脏产生急性反应蛋白，增加凝血因子的数量，最终在血小板聚集过程中起促进作用；(3)可促进细胞表达细胞间黏附分子1(ICAM-1)，增强嗜中性粒细胞的黏附作用，促进嗜中性粒细胞释放氧自由基，加重细胞损伤。因此推测出，丹参通过阻断IL-6受体，抑制IL-6活性影响血小板与胶原受体相互作用，从而抑制血小板聚集。本研究发现，丹参中的木犀草素可直接作用于IL-6靶点，发挥抑制血小板聚集的作用。IL-6刺激后STAT3激活，STAT3靶点是细胞内一条极其重要的信号转导途径，它与血小板生成和聚集密切相关，其在血小板生成中不仅参与血小板的形成和成熟，也参与血小板的活化和聚集。因此抑制STAT3靶点活性有助于抑制血小板活化和聚集[12]。血管内皮生长因子A(VEGF-A)是人类中由VEGFA基因编码的蛋白质，该基因是血小板衍生生长因子(PDGF)/血管内皮生长因子(VEGF)家族的成员，并且编码通常作为二硫键连接的同型二聚体发现的蛋白质。该蛋白质是糖基化的有丝分裂原，其特异性地作用于内皮细胞并具有多种作用[14]，包括介导增加的血管通透性，诱导血管生成、血管发生和内皮细胞生长，促进细胞迁移和抑制细胞凋亡，VEGF-A显示出与血管内皮细胞的显著活性。在体外，VEGF-A已被证明可刺激内皮细胞有丝分裂和细胞迁移。VEGF-A也是血管扩张剂，增加微血管通透性，最初被称为血管通透因子。丹参中的活性成分可直接作用于VEGFA靶点抑制其活性，从而抑制血小板活性和血小板聚集。

依据GO富集分析结果可知，丹参对血小板聚集作用机制BP主要涉及血管收缩、循环系统血管功能、血管大小调节、血管直径调节、平滑肌细胞增殖等。本研究发现，丹参中的丹参酮和丹参酚酸类成分可能主要通过保护血管内皮、调节血管大小和直径等多靶点发挥对血小板聚集的作用，可调节血管张力、松弛血管平滑肌、舒张血管、改善血管痉挛、抑制血小板黏附聚集。丹参通过调节GPCRs的分子功能，在血栓形成过程中，GPCRs信号在血小板活化中起着重要作用。病理因素引起的血小板异常活化通常与血管疾病和血栓形成有关。血小板激活和聚集影响可溶性受体激动剂，刺激细胞内信号通过GPCRs，丹参通过在GPCRs信号通路中多靶点作用于抗血小板而显著抑制激动剂诱导的血小板活化。丹参抑制二磷酸腺苷(ADP)与血小板表面G蛋白偶联受体与血小板ADP受体亚基(P2Y1和P2Y12)的结合，抑制血小板的激活和ADP的释放。P2Y12与G蛋白偶联提高其他血小板激动剂的活化效率，本研究发现，丹参中的脂溶性成分如丹参酮ⅡA是G蛋白偶联P2Y12拮抗剂，可抑制血小板聚集。

依据KEGG富集分析结果可知，在治疗过程中相关度较高的通路有白细胞介素17(IL-17)信号通路、血清低氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路、T细胞受体信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)信号通路、癌症蛋白聚糖、P2Y12-Gi信号通路等。炎症是血小板活化和聚集的关键触发因子，可诱导内皮损伤，从而导致生理抗凝剂的缺失及血管舒张功能减弱；炎症还可增加促凝因子的释放，抑制溶解纤维蛋白的活性，从而促进血小板聚集，IL-17信号通路在急性和慢性炎症反应中都起着至关重要的作用，已有研究表明，丹参通过IL-17信号通路抑制血栓中中性粒细胞的浸润及NETs的形成，还可下调内皮细胞中p38的表达，抑制内皮细胞的活化[15]，从而发挥抑制血小板聚集的作用。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)是血小板活化过程中细胞内信号的关键传递素。PI3K/Akt信号通路是目前发现的血小板活化主要通路，为生物体内重要的生存信号通路。丹参介导PI3K/Akt信号通路阻断钙离子通道，抑制血管平滑肌收缩偶联，舒张血管，发挥抗血小板活化的功能[16]。丹酚酸A(SAA)和丹酚酸B (SAB)是丹参的水溶性成分，增加血小板cAMP通路，SAB增加cAMP通过调节磷酸二酯酶的活性水平(PDE)[17]。SAA抑制PI3K/Akt信号通路中PI3K下游磷酸化和抗血小板聚集。SAB是一种P2Y12受体拮抗剂，通过原子力显微镜(AFM)直接降低ADP和P2Y12受体之间的作用力，并通过与胶原受体相互作用抑制血小板黏附。HIF-1信号通路参与红细胞和血管生成、糖和氨基酸代谢调节等基因调控而发挥作用，丹参介导HIF-1信号通路降低缺血、缺氧脑组织的细胞凋亡，降低脑组织的损伤，降低HIF-1α水平[18]，抑制血小板的聚集。丹参中的活性化合物通过干预ADP诱导的P2Y12-Gi信号通路相关的多个靶点，协同作用使血小板聚集。ADP可刺激血小板与P2Y12受体结合，激活P2Y12-Gi信号通路。ADP介导的P2Y12受体活化通过高浓度的环腺苷酸单磷酸(cAMP)和部分通过PI3K依赖性通路来减轻对其他激动剂的抑制作用，从而促进对其他激动剂的反应[19-20]。P2Y12偶联的Gi与cAMP水平的抑制有关，这会导致GPⅡb/Ⅲa等整合素的暴露，这些整合素通过与纤维连接蛋白或纤维蛋白原等适配器分子结合促进血小板聚集。磷酸二酯酶(PDE)是cAMP的抑制剂，控制cAMP[21]的降解。P2Y12偶联的Gi也与PI3K活性有关，PI3K通过催化调控蛋白激酶B(Akt)和Ras相关蛋白1b(Rap1b)的活性与GPⅡb/Ⅲa的激活有关。已有文献报道Rap1b活化对GPⅡb/Ⅲa的持续活化具有重要意义[22-23]。丹参调控的信号通路见图4。

图4 丹参调节血小板聚集的P2Y12-Gi蛋白偶联受体信号

综上所述，丹参不同成分通过抑制STAT3、IL-6、EGFR、ESR1、VEGFA、FOS、CDKN1A、IL-4、NR3C1、CHRM2、EDNRA、IL-2、AR、CASP3、HTR2A、HTR2C、OPRD1、OPRM1、ADRA1A、ADRA1D、ADRA2A等关键蛋白介导血管收缩、循环系统血管功能、血管大小调节、血管直径调节、平滑肌细胞增殖等来调控血小板聚集，影响血小板活化的不同信号通路，尤其是P2Y12-Gi受体通路。丹参的抗血小板活性可能取决于多化合物和多靶点的共同干预作用。本研究揭示了丹参调控血小板聚集是多成分、多靶点、多通路的BP，体现了中医中药治疗疾病的整体观念，为后期的临床应用奠定了理论基础。但网络药理学对靶点和通路的预测尚存在局限性，有待后期临床实验的进一步证实。