响应面法结合信息熵理论优化紫姜总黄酮的提取工艺

李 格，张 静，韩福国，郝艳丽，范雪梅，赵重博，刘清飞*

(1.陕西中医药大学，咸阳 712046；2.清华大学药学院，北京 100084)

紫姜为多年生姜科植物小花山柰(Kaempferiaparviflora)的根茎，主产于泰国北部和东北部、老挝、东南亚一带，又称泰国人参，因其呈深紫色至黑色，故又称为黑姜[1]。紫姜具有悠久的应用历史，主治炎症、溃疡、痛风、变态反应、胃肠功能紊乱等多种疾病[2]。现代药理研究表明，紫姜的药理作用主要包括抗炎、抗癌、抗变态反应、抗菌和抗高血压等，这与其所含活性成分甲氧基黄酮类成分有关[3-4]，但关于紫姜中黄酮类成分的提取工艺未见相关报道。

为了进一步对紫姜中黄酮类成分进行深入研究，有效开发利用紫姜资源，本实验采用响应面法结合信息熵理论，进行多指标综合评价，对紫姜黄酮类成分的提取工艺进行优化。其优点在于响应面法可连续对实验各因素水平进行分析，能够将各因素具有代表性的条件进行组合实验，回归拟合各因素与响应值的函数关系并进行分析，给出三维立体曲面图[5-6]，更直观地观察出优化区域，选择实验设计中的优化条件[7]。信息熵理论作为一种客观评价提取工艺的新方法，将多项评价指标综合成单一的度量指标，对多指标进行综合评价，从而确定最佳工艺参数[8]。

1 仪器与试药

1.1仪器 LC-20AT型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；RT-12SF型粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；MS104S型分析天平(宁波新芝生物科技股份有限公司)；LD5-2B型离心机(北京京立离心机有限公司)；Milli-Q型超纯水仪(美国Milipore公司)。

1.2试药 紫姜药材购于广西楷泰生物科技有限公司(批号201805)，经中国医学科学院药用植物研究所陈曦研究员鉴定为姜科植物小花山柰(Kaempferiaparviflora)的干燥根茎。对照品：3′，4′，5，7-四甲氧基黄酮(批号A13O11W127279，质量分数为95%)；3，5，7-三甲氧基黄酮(批号Y06N11W130397，质量分数为98%)；3，5，7，4′-四甲氧基黄酮(批号Y16O11W127642，质量分数为98%)，均购自上海源叶生物科技有限公司。5，7，4′-三甲氧基黄酮对照品(批号C116685430，质量分数为98%)，上海麦克林生化科技有限公司；5，7-二甲氧基黄酮对照品(批号201512，质量分数为95%)，上海一基实业有限公司；3，5，7，3′，4′-五甲氧基黄酮对照品(批号DL019201，质量分数为98%)，北京盈泽纳新化工技术研究院与北京普天同创生物科技有限公司联合研制；乙腈(色谱纯)，Sigma-Aldrich公司；甲酸(色谱纯)，北京现代东方精细化学品有限公司。化学结构式见图1。

图1 紫姜中6种黄酮类成分的化学结构式

2 方法与结果

2.1HPLC法测定6种黄酮类成分含量

2.1.1色谱条件 Lichrospher RP-18 endcapped色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流动相：0.5 mL·L-1甲酸(A)-0.5 mL·L-1甲酸乙腈(B)，梯度洗脱(0～10 min，38%B；10～20 min，38%B～40%B；20～35 min，40%B；35～50 min，40%B～44%B；50～55 min，44%B～38%B；55～60 min，38%B)。流速：0.8 mL·min-1；柱温：30 ℃；检测波长：350 nm，进样量：10 μL。色谱图见图2。

图2 HPLC图

2.1.2混合对照溶液的制备 精密称取6种成分的对照品适量，置于10 mL量瓶中，加乙醇溶解并定容，制成质量浓度分别为102.00、296.25、213.00、262.50、102.50、86.80 μg·mL-1的混合对照品溶液，混匀后置于4 ℃冰箱中冷藏，备用。

2.1.3供试品溶液的制备 取紫姜干燥药材，粉碎，过4号筛，精密称定药材粉末1 g，置于具塞锥形瓶中，按照液料比加入一定体积分数的乙醇，超声提取2次，以3 500 r·min-1离心10 min，合并上清液，上清液即为供试品溶液，4 ℃冷藏保存。取供试品溶液适量，置于2 mL EP管中稀释一定倍数，用0.45 μm微孔滤膜过滤，进样分析。

2.1.4线性关系考察 精密称取6种对照品适量，加乙醇制成质量浓度分别为200.0、592.5、426.0、523.0、205.0、108.5 μg·mL-1的混合对照品溶液，用乙醇稀释成系列质量浓度的溶液，按照2.1.1项下色谱条件进行检测分析，记录峰面积值。将所得峰面积(y)与各对照品质量浓度(x)进行线性回归。结果见表1。

表1 甲氧基黄酮类成分的回归方程及线性范围

2.1.5精密度实验 精密吸取2.1.2项下制备的混合对照品溶液，按照2.1.1项下色谱条件连续进样6次，记录各组分峰面积。计算6种成分峰面积RSD值依次为0.69%、0.68%、0.50%、0.71%、0.78%、0.87%，表明仪器精密度良好。

2.1.6稳定性实验 精密称取同一批供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、8、12、24 h进样测定，记录峰面积。计算6种成分峰面积RSD值分别为0.36%、0.15%、0.27%、0.72%、0.27%、0.13%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.7重复性实验 取紫姜药材粉末，按照2.1.3项下方法平行制备6份供试品溶液，并按照2.1.1项下色谱条件依次进样6次。计算6种成分峰面积RSD值分别为0.35%、0.45%、0.34%、0.44%、0.79%、0.15%，表明该方法重复性良好。

2.1.8回收率实验 精密称取含量已知的紫姜粉末6份，每份1 g，按照2.1.3项下方法平行制备6份供试品溶液，精密加入等量的对照品，按照2.1.1项下色谱条件进样3次。计算6种成分的平均回收率依次为101.17%、100.98%、107.54%、101.50%、104.81%、101.34%。RSD值分别为0.03%、0.03%、0.00%、0.02%、0.01%、0.01%，表明该方法回收率高，结果准确、可靠。

2.2甲氧基黄酮类成分超声提取工艺单因素考察 为了优化紫姜中6种主要甲氧基黄酮类成分超声提取工艺，分别对乙醇体积分数、液料比、超声时间进行单因素考察，按照2.1.3项下方法制备供试品溶液，按照2.1.1项下色谱条件进样分析。

2.2.1乙醇体积分数考察 固定液料比为25∶1，超声时间为50 min，设置乙醇体积分数分别为20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%。以各成分的含量对乙醇体积分数作图，见图3A。随着乙醇体积分数的增大，各成分含量趋势基本一致，乙醇体积分数在20%～50%时，各成分含量呈上升趋势，乙醇体积分数在50%～90%时，各成分含量趋平。故选取乙醇体积分数为40%～60%进行优化考察。

2.2.2液料比考察 固定超声时间为50 min，乙醇体积分数为50%，设置液料比分别为5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1，各成分的含量对液料比作图，见图3B。由图3B可知，随着液料比的增大，各成分含量趋势基本一致。当液料比在5∶1～10∶1时，各成分含量呈上升趋势，当液料比在10∶1～40∶1时，各成分含量几乎未变。故选取液料比在5∶1～15∶1范围内进行优化考察。

2.2.3超声时间考察 固定液料比为10∶1、乙醇体积分数为50%，设置超声时间分别为20、30、40、50、60、70、80、90 min，各成分的药材百分含量对超声时间作图，见图3C。由图3C可知，当超声时间在20～30 min时，只有3种成分含量有明显的增加，当超声时间在30～90 min时，只有1种成分在70 min时含量有明显的增加，其他化合物的含量几乎不变。出于实际生产考虑，选择超声时间在30 min较为合适，故选取超声20～40 min进行优化考察。

图3 不同因素对提取效果的影响

2.3响应面法优化紫姜中甲氧基黄酮类成分 参考有关中药中总黄酮的提取工艺[9-14]，结合单因素考察结果，设定各因素最佳取值范围，采用响应面法结合信息熵理论对该工艺进一步优化。

2.3.1响应面实验设计 根据响应面组合实验原理，以乙醇体积分数(A)、液料比(B)和超声时间(C)为考察因素，以6种甲氧基黄酮类成分在的含量计算所得综合评分(M)为评价指标，采用三因素三水平响应面法进行优化实验设计，因素与水平见表2，方案与结果见表3。由于提取次数不是连续变量因素[14]，故将其设置为2次。

表2 响应面实验因素与水平

2.3.2M值的计算 以紫姜中6种主要的甲氧基黄酮类成分的含量为指标，采用信息熵法[15]，计算各指标的权重系数和M值，建立原始评价指标矩阵(Xij)mn，对表中数据进行处理，建立概率矩阵(Pij)mn，将原始评价矩阵转为“概率矩阵”。

计算每项指标的信息熵，得到评价指标的信息熵Hi={0.999 8、0.997 3、0.998 2、0.998 3、0.997 9、0.998 0}；计算第i项指标的权重系数Wi={0.019 0、0.257 1、0.171 4、0.161 9、0.200 0、0.190 5}；计算M值。

(Mi为6种成分含量，Mimax为各成分的最高含量，Wi为各成分权重系数)。结果见表3。由表3可知M值在0.670～0.987之间。

2.3.3模型拟合与方差分析 通过Design-Expert 10.0.7软件分析实验结果，以M作为响应值，得到乙醇体积分数(A)、液料比(B)和超声时间(C)的二项式回归拟合方程。

M=0.96+0.06A+0.089B-0.012C-0.016AB-9.325×10-3AC-8.45×10-3BC-0.013A2-0.1B2-0.019C2

方差分析结果见表4。由表4可知，模型F值为62.19，整体模型的显著水平为P<0.000 1，表示此回归模型极显著，说明各指标和M值的关系可以运用此模型来函数化；失拟项F=6.85，P=0.047 0<0.05，可用该方程代替真实实验进行分析，同时从软件分析数值可以得到模型的R2为0.987 6，Radj2为0.971 8，说明回归方程的拟合度良好；差异系数为1.79，实验精确度良好，以上数据表明，该模型可以很好地被用来预测紫姜中主要黄酮类成分的提取工艺的优化。因素A、B、B2以及C2对M值的影响极为显著(P<0.000 1)，而因素C、A2以及交互项AB、AC、BC对M值影响无显著差异(P>0.05)。

2.3.4两两因素交互作用分析 利用Design-Expert 10.0.7软件对表3中数据进行拟合，得到两两因素的交互作用对M值影响的响应面图与等高线图，结果见图4。利用响应面图可以对影响M值的任意2个因素的交互效应进行分析与评价，曲面陡峭呈钟罩形即表示交互作用显著，曲面平滑则相反，等高线图的形状可反映交互效应的强弱，椭圆表示两因素交互作用显著，圆形则相反。

图4 各因素交互作用对综合评分影响的响应面图和等高线图

由图4可知，固定乙醇体积分数，随着液料比的增加，M值呈先升后降的趋势，在乙醇体积分数为55%～60%、液料比为11∶1～15∶1时，M值最高。固定液料比，M值随着乙醇体积分数增加呈增高趋势，而提取时间对M值的影响并不明显，当乙醇体积分数为55%～60%、提取时间为20～25 min时，M值最高。由相应的等高线图可知，乙醇体积分数所呈现的等高线分布较为密集，说明乙醇体积分数对M值的影响较提取时间大，根据等高线的椭圆规则来判断乙醇体积分数和提取时间有较为显著的交互作用，当乙醇体积分数不变时，提取时间的增加对M值大小的影响并不明显，可能原因是部分甲氧基黄酮类化合物在超声过程中结构受到了破坏或发生转变，故提取时间不宜过长。固定提取时间，随着液料比的增加，M值呈先升后降的趋势，在液料比为11∶1～15∶1、提取时间为20～25 min时，M值最高。通过模拟分析优化工艺为：乙醇体积分数为60%，液料比为11.93∶1，提取2次，每次23.41 min，预测M值为1.024，考虑到生产实际操作，最终将其确定为乙醇体积分数为60%，液料比为12∶1，提取2次，每次25 min。

2.3.5优化工艺验证 精密称取3份药材，每份1.0 g，按照2.3.4项下优化工艺提取，其验证结果M值为0.994，RSD值为0.34%，在此条件下，6种成分的提取率分别为0.09%、0.71%、2.89%、1.22%、0.40%、0.49%，总提取率为5.80%，验证实验M值与模型预测值高度接近，表明模型准确可信，可用此方法提取紫姜中6种甲氧基黄酮类成分。

3 讨论

黄酮类化合物是一大类天然有机产物，广泛存在于植物中，是许多中草药的有效成分之一，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化自由基、抗炎镇痛、抗衰老[16]等多种生物活性，是国内外医药领域研究的热点[17]。甲氧基黄酮类化合物是紫姜的主要成分[18-19]，脂溶性较好，易吸收，含有多个甲氧基独特结构，在抗癌活性的筛选过程中较其他黄酮显现出更强的抗癌活性[20]。为了更好地开发利用紫姜资源，有必要对紫姜中甲氧基黄酮进行更加深入、系统地研究。

文中运用响应面法结合信息熵理论对紫姜中的主要成分进行提取工艺的优化。响应面法通过拟合二次多项数学方程构建响应曲面，用较少的实验次数对其交互作用进行全面的分析[21]，通过对乙醇体积分数、液料比和超声时间的多元回归及二项拟合建立M值与各因素的回归方程，计算紫姜中各指标的含量变化规律。但对于多变量的研究，单纯的运用响应面法并不能精确地构造用于确定性分析的近似多项式。因此，本实验联合运用信息熵理论，分析各因素的交互作用，更加客观、清楚地反映出各成分在不同提取条件下的变化规律，筛选出优化工艺，提高了实验的严谨性和科学性，实验结果进一步表明筛选出的优化工艺能有效提高紫姜中甲氧基黄酮类成分的提取率，为紫姜的进一步研究开发提供参考。