RP-HPLC法测定乙肝宁颗粒中3种成分的含量

赵中霞，刘 宏，陈海霞，高向群，蔡亚琳

(1.石家庄市第八医院精神五科，石家庄 050081；2.石家庄市第三医院药剂科，石家庄 050000；3.河北医科大学附属第二医院药剂科，石家庄 050000)

慢性乙型肝炎是我国常见的慢性传染病之一，严重危害人民健康，中药制剂治疗慢性乙型肝炎在我国应用广泛[1]。乙肝宁颗粒是由黄芪、金钱草、茵陈、蒲公英、制何首乌、牡丹皮和川楝子等13味药材经煎煮、过滤、浓缩、制粒等工艺加工制成的中药颗粒剂，具有补气健脾、活血化瘀、淸热解毒的功效，临床主治慢性肝炎，属脾气虚弱、血瘀阻络、湿热毒蕴证，症见胁痛、腹胀、乏力、尿黄，对急性肝炎属上述证候者有一定疗效；方中茵陈有清利湿热、利胆退黄等功效[2-5]，金钱草有利湿退黄、利尿通淋、解毒消肿等功效[6-9]，蒲公英有清热解毒、消肿散结、利尿通淋等功效[10-13]；由于我国慢性乙型肝炎患者众多，乙肝宁颗粒临床应用极为广泛，因此加强对乙肝宁颗粒中药制剂的质量控制，具有积极意义[14-21]；乙肝宁颗粒收载于《中国药典》2020年版中，质量标准中采用蒸发光散射检测器测定[22]黄芪甲苷，含量测定项目单一，不能更好地控制乙肝宁颗粒的产品质量；故本研究采用RP-HPLC法测定乙肝宁颗粒中绿原酸、槲皮素和咖啡酸的含量。

1 仪器与试药

1.1仪器 1260 Infinity Ⅱ型高效液相色谱仪，包括G1322A型在线脱气机、G1329A型自动进样器、G1314B型PDA检测器、OPEN-LAB 色谱工作站(美国安捷伦公司)；Phenomenex SuperLu C18液相色谱柱(美国菲罗门公司)；FA2104型电子分析天平(上海润昕公司)；KQ-600BY型超声波清洗机(济宁科强超声检测仪器有限公司)；Milli-Q A10 型超纯水处理器(美国密理博公司)。

1.2试药 乙肝宁颗粒(规格：17 g·袋-1，批号分别为20181106、20190305、20190415)，九芝堂股份有限公司。对照品：绿原酸(批号110753-201817，质量分数为96.8%)，槲皮素(批号100081-201610，质量分数为99.8%)，咖啡酸(批号110885-201703，质量分数为99.7%)，均购自中国食品药品检定研究院。甲醇、乙腈为色谱纯，购自美国Merck公司；其他试剂均为分析纯，国药集团化学试剂厂；实验用水为自制超纯水。

2 方法与结果

2.1色谱条件 采用Phenomenex SuperLu C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流动相：乙腈(A)-3 mL·L-1磷酸(B)，梯度洗脱(0～5 min，7%A；5～26 min，7%A～65%A；26～28 min，65%A～7%A；28～35 min，7%A)；检测波长：341 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：25 ℃；进样量：20 μL。

2.2溶液的制备

2.2.1混合对照品储备液 取3种成分对照品，加体积分数为75%的甲醇制备成质量浓度分别为3 872、2 991、399.2 μg·mL-1的单一对照品溶液，精密移取3种单一对照品溶液各1.0 mL，置于10 mL量瓶中，加体积分数为75%的甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2混合对照品溶液 精密量取2.2.1项下制备的混合对照品储备液1.0 mL，置于10 mL量瓶中，加体积分数为75%的甲醇定容至刻度，摇匀，即得。

2.2.3供试品溶液 取乙肝宁颗粒，研成细粉，混匀，精密称取1.0 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入体积分数为75%的甲醇20 mL，称定质量，超声处理20 min(超声功率200 W，频率60 Hz)，放冷至室温，再称定质量，用体积分数为75%的甲醇补足减失的质量，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.4阴性对照溶液 根据乙肝宁颗粒制备方法和药材配比比例，按照2.2.3项下方法制备缺茵陈、金钱草和蒲公英的单一阳性对照溶液以及分别缺少3种药材的阴性对照溶液。

2.2.5空白溶液 按照2.2.3项下方法制备不含供试品的空白溶液。

2.3方法学考察

2.3.1系统适用性实验 取2.2项下制备的混合对照品溶液、供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。理论塔板数按照绿原酸峰计算应不低于2 000，分离度均大于1.5，基线分离良好。见图1。

2.3.2专属性实验 分别取2.2项下制备的混合对照品溶液、阴性对照溶液和供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果发现，阴性对照溶液在与绿原酸、槲皮素和咖啡酸相同保留时间处无干扰峰，表明该方法专属性良好。见图1。

图1 HPLC图

2.3.3线性关系考察 精密量取2.2.1项下制备的混合对照品储备液，分别加体积分数为75%的甲醇定容至刻度，摇匀，制成系列混合对照品溶液；按照2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图；以待测成分峰面积为纵坐标(y)、质量浓度为横坐标(x)进行线性回归，绘制标准曲线。结果见表1。

表1 3种成分线性方程、线性范围及相关系数

2.3.4回收率实验 取乙肝宁颗粒(批号20181106)，研成细粉，混匀，精密称取1.0 g，共6份，置于具塞锥形瓶中；分别加入2.2.1项下制备的3种单一对照品溶液，后续按照2.2.3项下方法进行前处理，得加标供试品溶液6份，按照2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图，根据峰面积计算3种成分的平均回收率，结果见表2。

表2 回收率实验结果 (n=6)

2.3.5稳定性实验 取乙肝宁颗粒(批号20181106)，按照2.2.3项下方法制备供试品溶液，室温下放置0、2、4、6、12、24 h，按照2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图，计算得3种成分峰面积RSD值分别为1.5%、1.2%、1.8%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.6重复性实验 取同一批次乙肝宁颗粒(批号20181106)，按照2.2.3项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图，计算3种待测成分的含量，根据6次检测结果计算RSD值。结果3种成分含量的RSD值分别为1.9%、1.6%、2.1%，表明该方法重复性良好。

2.3.7精密度实验 取2.2.2项下制备的混合对照品溶液，按照2.1项下色谱条件进样测定，连续进样6次，记录色谱图；根据6次峰面积测定值计算RSD值，结果3种成分峰面积RSD值分别为1.7%、1.3%、2.0%，表明仪器精密度良好。

2.4样品含量检测 取乙肝宁颗粒，按照2.2.3项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图，根据峰面积计算样品中3种成分的含量，结果见表3。

表3 含量检测结果

3 讨论

3.1检测波长的选择 分别取3种成分对照品，按照2.2.1项下方法配制成质量浓度均为5.0 μg·mL-1的单一对照品溶液，在200～400 nm波长范围内进行全波长扫描，结果3种成分分别在328、324、359 nm波长处有最大吸收。分别取2.2项下制备的混合对照品溶液、阴性对照溶液和供试品溶液，按照2.1项下色谱条件，设定采集波长范围为320～360 nm，分别采集色谱图；实验证明，检测波长为341 nm时，3种待测成分响应良好，定量结果准确，阴性对照无干扰。光谱图见图2。

图2 紫外光谱图

3.2流动相的选择 保持其他色谱条件不变，分别选择甲醇-水、乙腈-水、甲醇-3 mL·L-1磷酸和乙腈-3 mL·L-1磷酸作为流动相体系进行比较，结果采用等度条件时，待测成分与未知杂质峰重叠，且分析时间较长，故实验采用梯度洗脱法。选择乙腈-3 mL·L-1磷酸作为流动相时，3种成分色谱峰峰形尖锐，分离度均大于1.5，阴性对照溶液无干扰。因此实验选择乙腈-3 mL·L-1磷酸作为流动相。

3.3提取方法的选择 实验分别选择甲醇以及体积分数分别为95%、75%、50%的甲醇作为提取溶剂，超声10、15、20、25、30 min进行提取效果比较，结果发现，采用体积分数为75%的甲醇超声20 min时，对乙肝宁颗粒中3种成分的提取效果最佳，提取率大于90%，且基质干扰较小，定量结果准确。

综上所述，本研究建立了能同时测定乙肝宁颗粒中3种成分含量的RP-HPLC法，该方法操作简单、检测结果准确、重复性好、稳定性高，可用于乙肝宁颗粒的质量控制，为国家标准的完善提供参考。