基于HPLC-ELSD法的银柴胡中甾醇类成分含量测定

王秀芬，李 静，方光明，马学琴

(1.宁夏职业技术学院，银川 750021；2.宁夏医科大学，银川 750001)

1 仪器与试药

1.1仪器 1220型高效液相色谱仪，1260B型蒸发光散射检测器(美国安捷伦公司)；CPA225D型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；XPE26型百万分之一电子分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；YER-201D型旋转蒸发器(巩义市予华仪器有限公司)；FW135型中药粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；15C4390型超声波清洗机(宁波新芝生物科技有限公司)。

1.2试药 本实验药材采自内蒙、陕西、甘肃和宁夏，经杭州医学院药学院生药室主任吴晓宁教授鉴定为石竹科植物StellariadichotomaL.var.lanceolataBge.的干燥根。α-菠甾醇(批号ZZS-20-106-A6，质量分数为97%)、豆甾-7-烯醇(批号3632-091A4，质量分数为97.5%)，均购于上海甄准生物科技有限公司；甲醇、乙腈均为色谱纯(Fisher Chemical公司)；水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1色谱条件 采用SHIMADZU Shim-pack GIST C18色谱柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；ELSD参数：载气流速为1.6 L·min-1；漂移管温度：70 ℃；喷雾器温度：30 ℃；流动相为甲醇-水(98∶2)；流速：1.0 mL·min-1；进样量：50 μL。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液 精密称取α-菠甾醇对照品适量，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容，制成质量浓度为0.215 mg·mL-1的α-菠甾醇对照品溶液；精密称取豆甾-7-烯醇对照品适量，置于50 mL量瓶中，加甲醇制成质量浓度为0.174 mg·mL-1的豆甾-7-烯醇对照品溶液。置于冰箱内冷藏。

2.2.2供试品溶液 精密称取银柴胡粉末(过3号筛)6.0 g，置于100 mL锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，摇匀，称定质量，超声(功率250 W，频率20 kHz)处理40 min，取出，放冷至室温，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，滤液用0.45 μm滤膜滤过，即得。

2.3系统适用性及专属性考察 分别精密吸取2.2项下制备的对照品溶液、供试品溶液和空白溶剂(甲醇)各50 μL，依照2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图，见图1。由图1可知，供试品色谱图中出现与对照品保留时间一致的色谱峰，2种成分峰的理论塔板数均不低于2 000，分离度均大于1.5，阴性对照无对应色谱峰，说明阴性对照对2种成分的测定无干扰，所建立的色谱条件专属性良好。

图1 HPLC-ELSD图

2.4线性关系考察 精密吸取2.2项下制备的α-菠甾醇对照品溶液适量，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别制成质量浓度为10.77、17.23、21.54、32.32、38.78、43.09 μg·mL-1的α-菠甾醇系列对照品溶液。另精密吸取2.2项下制备的豆甾-7-烯醇对照品溶液适量，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成质量浓度分别为8.7、23.2、34.8、46.4、58.0、69.6、81.2 μg·mL-1的豆甾-7-烯醇系列对照品溶液。精密吸取上述不同质量浓度的对照品溶液各50 μL，按照2.1项下色谱条件进样检测，记录峰面积。分别以各对照品峰面积对数值为纵坐标(y)、进样量对数值为横坐标(x)，绘制标准曲线，结果2种成分回归方程分别为y1=1.595 2x1+4.719 2(r1=0.998 3)，y2=1.488 3x2+4.801 6(r2=0.999 5)，质量浓度分别在10.77～43.09、8.70～81.20 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.5检测限和定量限考察 精密量取2.2项下制备的α-菠甾醇对照品溶液适量，加甲醇逐级稀释，分别以信噪比为2.25∶1与12.34∶1计算检测限和定量限，确定α-菠甾醇的检测限为0.107 5 μg，定量限为0.430 0 μg。按照2.2项下方法制备豆甾-7-烯醇对照品溶液(质量浓度为174 μg·mL-1)适量，分别以信噪比为5.35∶1、20.56∶1计算检测限和定量限，测得豆甾-7-烯醇的检测限为0.017 4 μg，定量限为0.087 0 μg。

“24以上、40岁以下的军人，给我站出来！”马国平凝视着在山坳里集合起来的连队，突然大吼一声，如同平地惊雷。

2.6精密度实验 精密吸取2.2.2项下制备的同一供试品溶液(内蒙)，按照2.1项下色谱条件连续进样6次，分别测定2种成分的峰面积，记录色谱图，计算RSD值。结果2种成分峰面积的RSD值分别为2.43%、2.16%，表明仪器精密度良好。

2.7重复性实验 取银柴胡药材粉末6份(内蒙)，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件分别测定2种成分的峰面积，计算含量。结果2种成分的平均含量(n=6)分别为0.017%、0.048%，RSD值分别为2.74%、2.54%，表明该方法重复性良好。

2.8稳定性实验 取2.2.2项下制备的同一供试品溶液(内蒙)，分别在0、2、4、6 h进样50 μL，分别测定2种成分的峰面积，计算RSD值。结果2种成分的RSD值分别为2.89%、2.04%，表明供试品溶液在6 h内稳定性良好。

2.9回收率实验 精密称取含量已知的银柴胡样品粉末6份，置于具塞锥形瓶内，按照1∶1的比例分别加入2.2.1项下制得的α-菠甾醇对照品溶液1.5 mL和豆甾-7-烯醇对照品溶液5.5 mL，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，依照2.1项下色谱条件进样。分别测定2种成分的含量，计算其平均回收率，结果见表1。由表1可知，2种成分的平均回收率分别为104.04%、96.50%，符合《中国药典》2020年版规定，且RSD值均小于3%，表明该方法准确性良好。

表1 2个甾醇类成分的回收率实验结果 (n=6)

2.10样品测定 按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件对10个不同批次的银柴胡药材中α-菠甾醇和豆甾-7-烯醇的含量进行测定，结果见表2。

表2 银柴胡的含量测定结果

3 讨论

3.1指标性成分的选择 银柴胡临床上主治疳积发热、骨蒸潮热等症[16]，含有甾醇类、环肽类、黄酮类等多种化学成分，其中甾醇类成分中的α-菠甾醇和豆甾-7-烯醇具有抗炎、解热作用，是银柴胡除虚热的主要活性成分，因此选择这2个成分作为指标性成分建立含量测定方法。

3.2检测器的选择α-菠甾醇和豆甾-7-烯醇为紫外末端吸收，无法使用紫外检测器进行含量测定。参考相关文献[17-19]，建立银柴胡中甾醇类活性成分的定量分析方法，同时对检测器漂移管温度、喷雾器温度、载气流速等进行考察，结果表明，该方法简便、灵敏、重复性好、准确度高。

3.3流速的选择 对色谱条件流动相的流速进行考察，流速分别设定为0.8、1.0、1.2 mL·min-1，取供试品溶液，分别按照上述不同流速下的色谱条件进样检测。流速为0.8 mL·min-1时，30 min内样品未出峰；流速为1.2 mL·min-1时，2种成分均未达到良好的分离效果；流速为1.0 mL·min-1时，在30 min内样品出峰，且2种成分分离效果较好。因此流速选择1.0 mL·min-1。

3.4提取溶剂的选择 根据2种成分的性质，选择甲醇、乙醇、氯仿等溶剂进行提取[20]，超声提取40 min后，放冷，滤过，作为供试品溶液，对其进行含量测定，其中甲醇与氯仿中2种成分的含量较高，提取效果较好，考虑到甲醇毒性小，对环境和人体健康影响小，成本低，最终确定甲醇作为提取溶剂。

3.5提取时间的选择 使用甲醇作为提取溶剂，采用超声处理，分别提取20、30、40、50 min，对银柴胡2种成分的含量进行考察，结果提取时间为40 min时2种成分的含量较高，超声处理40 min后含量变化不大，因此制备供试品选择超声处理40 min。

本研究采用HPLC-ELSD法建立了银柴胡药材中甾醇类成分α-菠甾醇和豆甾-7-烯醇的含量测定方法，为银柴胡药材的质量控制提供了简便、高效的方法，为提升银柴胡药材的质量标准提供参考。