UPLC法同时测定感冒解痛散中10种成分的含量

张 丹，王小旭，谢贺贺

(1.黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040；2.北京德立福瑞医药科技有限公司，北京 102101)

感冒解痛散由荆芥、白芷、陈皮、苍术、甘草和麻黄6味中药制备而成，收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第十一册，具有祛风除湿散寒、宣肺化痰止咳的功效，主治风寒咳嗽、鼻流清涕、恶寒无汗、头痛身困等症[1]。中药复方制剂成分复杂，临床疗效是多味药材中多成分协同作用的结果，为保证中药质量，需对处方药材的特征成分及有效成分进行定量测定，同时需尽量涵盖方中的大部分药材。本处方中荆芥辛苦而温、芳香而散，具有解表祛风、镇痛抗炎之功效，临床主治风寒感冒、咽喉肿痛等症[2]；白芷祛风散寒、宣痹止痛，为臣药，为祛风散寒、通窍止痛、燥湿止带的要药[3]；方中陈皮归肺、脾经，性温味苦辛，能理气健脾、燥湿化痰[4]；苍术古称赤术，气芳香辛烈，能祛风燥湿、通络止痛[5]；麻黄苦辛性温，善开腠发汗，祛在表之风寒[6]；甘草清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药[7]。现行标准仅采用理化鉴别法和薄层色谱(TLC)法定性分析麻黄成分，缺少定量分析指标，无法全面、有效地控制该制剂的质量。文献报道仅有对感冒解痛散中橙皮苷的定量测定研究[8]，涉及药材有限，本文选择芹菜素、槲皮素、木犀草素、欧前胡素、异欧前胡素、橙皮苷、川陈皮素、苍术素、甘草苷和盐酸麻黄碱10种成分作为检测指标，利用超高效液相色谱法(UPLC)同时测定10种成分的含量，为制定和提升感冒解痛散的质量标准提供参考。

1 仪器与试药

1.1仪器 Waters超高效液相色谱仪(ACQUITY UPLC)仪，包括QSM二元溶剂管理器、二极管阵列检测器(PDA)，SM-FTN样品管理器、CH-A型柱温箱和Empower3色谱工作站，美国Waters公司；ABS-135S型电子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；KQ-500DB型数控超声波清洗器(功率400 W，频率50 kHz)，昆山超声波仪器有限公司。

1.2试药 对照品：芹菜素(批号111901-201603，质量分数：99.2%)；槲皮素(批号100081-201610，质量分数：99.1%)；木犀草素(批号111520-201605，质量分数：99.6%)；欧前胡素(批号110826-201918，质量分数：99.0%)；异欧前胡素(批号110827-201812，质量分数：99.6%)；橙皮苷(批号110721-201918，质量分数：96.3%)；苍术素(批号111924-201906，质量分数：99.7%)；甘草苷(批号111610-201908，质量分数：95.0%)；盐酸麻黄碱(批号171241-201909，质量分数：99.9%)，均购自中国食品药品检定研究院。川陈皮素(批号MUST-15090814，质量分数：98.8%)，成都瑞芬思生物科技有限公司。荆芥(批号20181128，产地：安徽亳州)为唇形科植物荆芥SchizonepetatenuifoliaBrip.的干燥地上部分；白芷(批号180428，产地：河北安国)为伞形科植物白芷Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm.) Benth.etHook.f.或杭白芷Angelicadahurica(Fisch.Ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.var.formosana (Boiss.) Shan et Yuan的干燥根；陈皮(批号20181227，产地：广西)为芸香科植物橘CitrusreticulataBlanco.及其栽培变种的干燥成熟果皮；苍术(批号190307，产地：安徽六安)，为菊科植物茅苍术Atrac-tylodeslancea(Thunb.)DC.或北苍术Atractylodeschinensis(DC.)Koidz.的干燥根茎；甘草(批号20190219，产地：陕西)为豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.、胀果甘草GlycyrrhizainflataBat.或光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的干燥根和根茎；麻黄(批号20190908，产地：甘肃)为麻黄科植物草麻黄EphedrasinicaStapf中麻黄EphedraintermediaSchrenket C.A.Mey.或木贼麻黄EphedraequisetinaBge.的干燥草质茎。以上药材经鉴定均为真品。感冒解痛散(批号分别为：1801015、1801208、1900122、1903206、1900523、1900619，规格:10 g·袋-1)，吉林天益药业有限公司；甲醇、乙腈均为色谱纯，MERCK公司；磷酸(色谱纯)，天津益仁达科技有限公司；水为屈臣氏蒸馏水。

2 方法与结果

2.1色谱条件 Waters XTERRA C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)。流动相：乙腈(A)-8 mL·L-1磷酸(含0.1 mL·L-1三乙胺)(B)，梯度洗脱(0～6 min，12%A～36%A；6～10 min，36%A～52%A；10～16 min，52%A～78%A；16～18 min，78%A；18～20 min，78%A～12%A)。流速为0.2 mL·min-1；检测波长：0～4 min 237 nm(甘草苷)、4～6 min 215 nm(盐酸麻黄碱)、 6～10 min 360 nm(芹菜素、槲皮素、木犀草素、橙皮苷)、10～12 min 326 nm(川陈皮素)、12～16 min 249 nm(欧前胡素、异欧前胡素)、16～20 min 336 nm(苍术素)；柱温：35 ℃；进样量：2 μL[9-11]。

2.2溶液的制备

2.2.1混合对照品溶液 精密称取10种对照品适量，用甲醇配制成质量浓度分别为144.8、310.4、140.3、907.8、963.5、324.9、466.7、313.6、151.4、136.2 μg·mL-1的混合对照品溶液，经0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2.2供试品溶液 取感冒解痛散5袋，研匀，精密称取2.0 g，置于100 mL棕色量瓶中，加入体积分数为80%的甲醇80 mL，室温超声处理(400 W，40 kHz)45 min，取出，放冷至室温，用体积分数为80%的甲醇稀释至刻度，摇匀，以8 500 r·min-1离心5 min，取上清液，经0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2.3阴性对照溶液 按照感冒解痛散的工艺方法分别制备缺荆芥、白芷、陈皮、苍术、甘草、麻黄的阴性样品，按照2.2.2项下方法制备阴性对照溶液。

2.3系统适用性实验 分别精密吸取2.2项下制备的溶液，按照2.1项下色谱条件进样测定，结果理论塔板数均大于8 500，10种有效成分与相邻色谱峰之间的分离度大于1.5，10种有效成分色谱峰对称因子在0.99～1.05之间。色谱图见图1。

图1 HPLC图

2.4方法学考察

2.4.1线性关系考察 分别精密吸取2.2.1项下制备的混合对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL，分别置于50 mL棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得系列混合对照品溶液。按照2.1项下色谱条件测定，记录色谱图。以质量浓度为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y)进行线性回归，计算回归方程和相关系数。结果表明，10种成分在实验范围内线性关系良好；将对照品溶液逐级稀释后，以信噪比(S/N)为10时的质量浓度为各成分的定量限(LOQ)，以信噪比(S/N)为3时的质量浓度为各成分的检测限(LOD)。结果见表1。

表1 10种有效成分的回归方程及线性范围

2.4.2精密度实验 取2.2.1项下制备的混合对照品溶液，按照2.1项下色谱条件进样，重复进样6次。结果10种成分峰面积的RSD值(n=6)分别为0.49%、0.51%、0.63%、0.42%、0.39%、0.59%、0.61%、0.72%、0.54%、0.68%，表明仪器精密度良好。

2.4.3稳定性实验 取2.2.2项下制备的供试品溶液(批号1903206)，分别于制备后0、5、10、15、20、24 h按照2.1项下色谱条件进样。结果10种成分峰面积的RSD值(n=6)分别为0.79%、0.92%、1.05%、0.88%、1.02%、0.91%、0.75%、1.04%、0.82%、0.97%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.4重复性实验 取感冒解痛散(批号1903206)6份，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样测定。结果样品中10种成分的平均含量分别为0.130 6、0.300 2、0.111 3、0.625 8、0.731 2、0.262 3、0.351 4、0.211 7、0.089 2、0.074 5 mg·g-1，含量的RSD值 (n=6)分别为0.59%、0.91%、0.84%、0.77%、1.03%、0.89%、0.96%、1.11%、1.07%、1.24%，表明该方法重复性良好。

2.4.5回收率实验 精密称取含量已知的感冒解痛散(批号1903206)6份，每份1.0 g，分别置于100 mL棕色量瓶中，精密加入混合对照品溶液(10种成分质量浓度分别为0.025 3、0.056 6、0.022 2、0.119 8、0.139 4、0.052 2、0.069 1、0.040 2、0.017 6、0.014 3 mg·mL-1)5.5 mL，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，再按照2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图，计算得平均回收率在98.51%～100.95%范围内，RSD值分别为0.73%、0.54%、1.08%、0.52%、0.90%、0.91%、0.75%、0.51%、0.62%、0.64%(n=6)，结果表明该方法结果准确、可靠，见表2。

表2 10种成分的回收率实验结果 (n=6)

2.5样品含量测定 取感冒解痛散6批，分别按照2.2.2项下方法平行制备3份供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图及峰面积，结果见表3。

表3 各成分的含量测定结果 (n=3)

3 讨论

3.1质量控制指标的选择 感冒解痛散中荆芥为君药，其中的芹菜素、槲皮素、木犀草素等黄酮类化学成分具有抗炎解热、抗氧化、抗肿瘤的药理活性；香豆素类是白芷中生物活性最强的成分，最具代表性的是欧前胡素和异欧前胡素，具有抑制细菌、霉菌和清除氧化自由基的作用；研究表明，陈皮中二氢黄酮类橙皮苷和甲氨基黄酮苷类川陈皮素为主要有效成分，具有抗病毒、抑制炎症、抗菌等药理作用；苍术中苍术素属于聚乙烯炔类化合物，具有抗炎、利胆等作用，但其具有呋喃环，结构不稳定，应避光操作；甘草的含量测定指标为黄酮类化学成分甘草苷，在抗肿瘤、抗氧化、抗病毒方面作用显著。麻黄的主要活性成分为盐酸麻黄碱，是国家规定需要严格控制的毒、麻类成分，如果长期大量使用，会产生失眠、震颤、心悸等不良反应，感冒解痛散现行标准尚未将盐酸麻黄碱的含量作为质量控制指标。本研究参照《中国药典》2015年版对感冒解痛散中6味药材的指标成分进行控制，最终选择性质稳定、含量测定重复性好、药效确切的芹菜素、槲皮素、木犀草素、欧前胡素、异欧前胡素、橙皮苷、川陈皮素、苍术素、甘草苷和盐酸麻黄碱10种成分作为感冒解痛散的质量控制指标[12-14]。

3.2液相色谱仪的考察 高效液相色谱在中药学领域应用广泛，随着各种分析技术的不断革新，分析技术更加精细。近几年在HPLC的基础上，出现了UPLC技术，借助于HPLC的原理，涵盖了填料颗粒小、进样体积少、流速低及检测速度快等全新技术，相对于HPLC具有更好的分离效果、峰容量和灵敏度。本实验以感冒解痛散为研究对象，分别考察HPLC色谱仪和UPLC色谱仪，结果UPLC法相比HPLC法不仅显著缩短了分析时间(由70 min缩短到20 min)，且各主要成分的分离效果更好，灵敏度更强，测定结果准确、可靠，可用于感冒解痛散的质量控制[15-16]。

3.3色谱条件的优化 采用PAD检测器在190～400 nm全波长进行了筛选；对Waters XTERRA C18(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)、Agilent Zorbax C18(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)等色谱柱进行了筛选；对乙腈-水、乙腈-磷酸(1、5、8 mL·L-1)溶液及含不同量(0.1、0.5、1.0 mL·L-1)的三乙胺、甲醇-磷酸(1、5、8 mL·L-1)系统进行了不同梯度洗脱条件优选；对不同柱温(25、30、35 ℃)进行了优选；为提高测定的专属性、准确度和灵敏度，最终选择分段变换波长检测法对10种化学成分进行测定并优化得到了本研究所需的色谱条件。

目前关于感冒解痛散中有效成分的含量测定文献资料较少，本文建立了UPLC法同时测定感冒解痛散中10种成分的含量，与HPLC法相比大大缩短了分析时间，经精密度、稳定性、重复性、回收率等方法学验证结果准确、有效，可为感冒解痛散的质量评价提供参考。