HPLC-Q-TOF-MS/MS法分析防己茯苓汤的化学成分

刘杨，杨玉佩，沈冰冰2，*（1.湖南省药品检验研究院，长沙 410001；2.湖南省中医药研究院 中药研究所，长沙41001；.湖南中医药大学，长沙 410208）

防己茯苓汤是由防己、黄芪、桂枝、茯苓和甘草五味中药组成，来源于《金匮要略》中的水气病脉证篇，具有益气健脾、温阳利水之功效。现代临床主要用于治疗由脾心阳虚湿盛所致之水肿、慢性充血性心力衰竭、尿毒症和系统性红斑狼疮等[1-3]；也有在此方基础上进行加减味的复方，用于治疗肾病综合征、乳腺癌、帕金森等疾病[4-5]。但是有关复方防己茯苓汤全成分的化学分析报道较少，因此采用现代中药分析技术手段对其开展化学成分的研究迫在眉睫。其中，HPLC-Q-TOFMS/MS 具有高分辨、高灵敏度等特点，可快速获得目标物的分子离子峰和特征碎片离子，从而对复方中不同类型的化合物进行定性分析[6-7]。本研究首次采用HPLC-Q-TOF-MS/MS 对防己茯苓汤的化学成分进行分析与鉴定，以期为复方的质量控制以及药效物质的深入研究奠定基础。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1290 infinity 超高效液相色谱仪、Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF-LC-MS/MS 质谱仪（美国安捷伦公司）；Mettler Toledo AL204 型电子天平、Mettler Toledo XPE105 型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司），KM-500DB 型中文液晶台式超声波清洗器（昆山美美超声仪器有限公司）。

1.2 试药

乙腈色谱纯（德国Merck 公司），甲酸[色谱纯，阿拉丁试剂（上海）有限公司]，水为纯净水[华润怡宝饮料（中国）有限公司]，其余试剂均为分析纯。中药材防己、黄芪、桂枝、茯苓和甘草均购自湖南省自然堂中药饮片有限公司，经湖南省中医药研究院中药研究所助理研究员沈冰冰鉴定为防己科植物粉防己Stephania tetrandraS.Moore 的干燥根，豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao 的干燥根，樟科植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl 的干燥嫩枝，多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf 的干燥菌核，豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根。粉防己碱（纯度≥99.6%，批号：110711-201810）、防己诺林碱（纯度≥98.3%，批号：110793-201807）、去甲异波尔定（纯度≥96.9%，批号：111825-201201）、黄芪甲苷（纯度≥96.9%，批号：110781-201717）、甘草苷（纯度≥93.1%，批号：111610-201607）、毛蕊异黄酮苷（纯度≥98.1%，批号：111920-201606）（对照品，中国食品药品检定研究院）。

2 方法

2.1 溶液的配制

2.1.1 供试品溶液的制备 按防己茯苓汤处方比例（30∶30∶30∶40∶20）取防己、黄芪、桂枝、茯苓和甘草五味中药，分别按以下3 种方法进行制备：方法一加水600 mL 煎煮2 h；方法二加75%甲醇600 mL 回流提取2 h；方法三加75%甲醇600 mL 超声提取（功率：500 W，频率：40 kHz）30 min。分别提取完成后，过滤，减压浓缩至适量，定容至100 mL。摇匀，过0.22 μm 微孔滤膜，即可。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称量对照品粉防己碱5.16 mg，防己诺林碱5.23 mg，去甲异波尔定5.05 mg，黄芪甲苷 5.11 mg，甘草苷5.03 mg，毛蕊异黄酮苷5.27 mg，75%甲醇超声溶解，定容至25 mL 量瓶中。于4℃ 冰箱中避光保存，备用。进样前过微孔滤膜。

2.2 色谱和质谱条件

2.2.1 色谱条件 色谱柱为Agilent Zorbax SBC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流动相A 为0.1%甲酸水，B 为甲醇，梯度洗脱（0 ～7 min，2%B；7 ～25 min，2% ～30%B；25 ～40 min，30% ～35%B；40 ～48 min，38%B；48 ～60 min，38% ～72%B；60 ～80 min，72%B；80 ～85 min，72% ～100%B）， 进样量5 μL，流速1.0 mL·min－1，柱后分流检测，分流比为10∶1；柱温30℃。

2.2.2 质谱条件 离子化方式电喷雾离子化（ESI），在正、负离子模式分别采集，干燥气温度320℃，干燥气体积流量为8.0 L·min－1，鞘气温度350℃，毛细管电压3.5 kV，碎片电压145 V，碰撞能量分别采用 5、10、20、30、40 eV，质量数范围为m/z50 ～1200。

3 结果与分析

3.1 不同制备方法的对比

对3 种不同制备方法的样品分别进行HPLCQ-TOF-MS 检测分析，得到总离子流图（TIC）如图1所示。通过对比分析色谱峰的数目以及制备方法的时间，最终确定采用方法三进行制备。

图1 3 种不同制备方法的TIC 图Fig 1 Total ion chromatogram of 3 different preparation methods

3.2 成分鉴定

对方法三得到的防己茯苓汤进一步进行HPLC-Q-TOF-MS/MS 分析，分别得到正负离子模式下的总离子流图，结果如图2所示。结合对照品裂解规律以及相关文献资料对目标化合物进行分析鉴定，最终确定了36 个化合物，包括7个生物碱类，13 个萜类化合物，11 个黄酮类化合物，见表1。

图2 防己茯苓汤在正负模式下的TIC 图Fig 2 Total ion chromatogram of Fangji Fuling decoction in positive ion mode and negative ion mode

表1 防己茯苓汤的化学成分的HPLC-Q-TOF-MS/MS 鉴定Tab 1 Identification of chemical constituents of Fangji Fuling decoction by HPLC-Q-TOF-MS/MS

续表1

3.2.1 生物碱类 所有生物碱类化合物均来自植物粉防己，主要类型有双苄基异喹啉类、原小檗碱类和阿朴啡类生物碱等[9]。研究发现该类化合物只出现在正离子模式下，其中双苄基异喹啉类是头对头双二苯醚双苄基四氢异喹啉类，这类成分的结构特征主要是尾部的二苯醚键是C-3′与C-4′连接，头部是C-7 与C-8′连接，其质谱裂解特点就是双苄基的裂解。化合物10和13 的分子离子峰分别为609.2961[M ＋H]＋、623.3088[M ＋H]＋，双苄基的丢失生成特征离子m/z381 和m/z395，另外还有m/z190、m/z174、m/z160 等碎片离子的出现，具体裂解规律如图3所示。对比对照品，确定化合物分别为粉防己碱和防己诺林碱。

阿朴啡类生物碱根据N 上是否有甲基，会产生M-43 或M-29 的特征碎片离子峰，并且会出现失去一系列取代基（-OCH3，-CH3，-OH）的离子峰。化合物5 和8 的分子离子峰为342[M ＋H]＋，比较两者二级质谱裂解均出现299[M ＋H-C2H5N]＋，327，324 和310 等碎片离子，如图4所示。对比文献和保留时间确定化合物5 和8 分别为异紫堇定碱、紫堇定碱[10]。化合物6 具有和紫堇定碱一致的裂解规律，只是分子离子峰328.1568[M ＋H]＋相差14 Da，故确定该化合物为波尔定碱或异波尔定碱。而化合物7 产生了N 上没有甲基的M-29 特征碎片离子，对比对照品，确定化合物为去甲异波尔定。

图4 紫堇定碱的质谱裂解途径Fig 4 Fragmentation pathway of corydine

3.2.2 三萜类 复方中的三萜主要来源于茯苓、黄芪和甘草。其中，茯苓中的三萜主要是羊毛甾烷型三萜酸，根据3、4 位是否开环及碳碳双键的位置主要分为四大类[15]：羊毛甾-8 烯型（Ⅰ型）、羊毛甾-7，9（11）-二烯型（Ⅱ型）、3，4 开环-羊毛甾-8 烯型（Ⅲ型）和3，4 开环-羊毛甾-7，9（11）-二烯型（Ⅳ型）。分子离子峰在正负模式下都有较强的响应，主要以[M-H]－、[M ＋H]＋等形式存在。在二级质谱下，其裂解主要是由于C-3、C-16 和C-17 位上取代基的断裂引起的，并且3，4 开环类化合物与C-1 位相连的键极易断裂。化合物24 在ESI（＋）模式下响应较高，会丢失碳3、16、17 位上的取代基，生成相应的碎片离子峰469[M ＋H-C2H4O2]＋、511[M ＋H-H2O]＋、373[M ＋H-C9H16O2]＋，最终产生m/z295 的Ⅰ型特征离子；而化合物23 和25 产生的是Ⅱ型特征离子m/z293，如图5所示，对照文献[16]确定化合物24、23 和25 分别为茯苓酸、去氢茯苓酸和去氢齿孔酸。另外，化合物18，21和22 都属于Ⅳ型，在ESI（＋）模式下，17 位上的取代基丢失并同时失去一分子H2O 得到Ⅳ型特征离子m/z325，对照文献[15]确定分别为茯苓新酸 E、茯苓新酸 D 和茯苓新酸 B。

图5 茯苓Ⅰ型和Ⅱ型三萜的质谱裂解途径Fig 5 Fragmentation pathway of pachymic acid（type I）and dehydropachymic acid（type Ⅱ）

黄芪是一类较特殊的环阿屯烷型三萜皂苷，与羊毛甾烷型的差别在于C-10 位的甲基和C-9位脱氢形成三元环[18]。化合物30 分子离子峰807.4488[M ＋Na]＋会连续丢失一分子葡萄糖和一分子木糖，形成环黄芪醇骨架离子437 [M ＋H-Glc-Xyl-3H2O]＋，然后与17 位相连的E 环会断裂生成m/z125 特征碎片离子，这与对照品黄芪甲苷的裂解途径一致。此外，化合物28、33和34 也均产生了m/z437 和m/z125，对照参考文献[11]和保留时间分别确定为astrasieversianinⅡ、黄芪皂苷 Ⅱ和黄芪皂苷Ⅰ。

甘草中的三萜主要是齐墩果烷型，在ESI（＋）模式下主要以[M ＋Na]＋、[M ＋H]＋形式存在。在二级质谱裂解过程中，主要是糖键的连续性断裂以及取代基的丢失。化合物29 的分子离子峰为845.3883[M ＋Na]＋，在ESI（＋）模式下会连续失去两分子葡萄糖醛酸生成647[M ＋H-C6H8O6]＋和471[M ＋H-C12H16O12]＋， 然后母核的C 环发生RDA 裂解， 生成m/z263 和m/z209 两个特征碎片离子，从而确定化合物为甘草酸。化合物35 和36 的分子离子峰分别为823.4146 [M ＋H]＋和825.4380[M ＋H]＋，也会连续失去两个葡萄糖醛酸，得到m/z471 和m/z473 的骨架离子，但其具体取代位置无法确定，对照文献[12]确定化合物35 和36 为甘草皂苷K2和J2或其异构体。

3.2.3 黄酮类 黄芪中的化合物14、17、31 和32 都属于异黄酮类化合物。研究发现该类化合物在ESI（＋）模式下丰度较大，出现[M ＋Na]＋和[M ＋H]＋分子离子峰，并且其裂解规律与黄酮类差别不大，主要是C 环的RDA 裂解。化合物14 的分子离子峰469.1093[M ＋Na]＋，失去一分子葡萄糖形成母核285[M ＋H-Glc]＋，然后4′位的-OCH3容易丢失形成m/z255，最后发生RDA 裂解形成m/z137 的特征碎片例子。其裂解途径与对照品一致，故确定为毛蕊异黄酮苷。

甘草中的黄酮主要包括黄烷酮类、二氢黄酮类、查尔酮类等类型。黄烷酮类化合物主要是C环的RDA 裂解和B 环的断裂；而二氢黄酮类中A 环和B 环间连接的各个键都肯可能会裂解，从而产生相应的碎片离子。化合物11 在ESI（＋）模式下响应较高，发生RDA 裂解产生m/z137 的特征碎片离子峰，另外还出现257[M ＋H-Glc]＋，163[M ＋H-Glc-C6H6O]＋等离子峰，如图6所示，通过与甘草苷对照品的裂解途径对比，确定该化合物为甘草苷。化合物15、19 和20 是甘草苷的同分异构体。化合物15 的分子离子峰为441.1148 [M ＋Na]＋，失去一分子葡萄糖[M ＋H-Glc]＋后，A 环发生裂解得到二氢黄酮类的特征离子m/z109，对照文献[14]确定化合物为异甘草苷。根据极性大小与保留时间，化合物19 与20分别确定为新甘草苷和新异甘草苷。化合物16 与异甘草苷的裂解规律一致，仅多了个失去芹糖的离子峰419[M ＋H-Apiose]＋，因此确定该化合物为芹糖异甘草苷。

图6 甘草中甘草苷的质谱裂解途径Fig 6 Fragmentation pathway of liquiritin

4 讨论

本试验考察了3 种不同制备方法，最终采用75%甲醇超声提取法，并且首次对防己茯苓汤的化学成分进行HPLC-Q-TOF-MS/MS 快速分析。研究发现各成分在ESI（＋）模式的响应较强，所以本试验主要针对正模式下的质谱裂解规律进行了分析总结，最终对比对照品以及相关参考文献，共鉴定了36 个化合物，包括7 个生物碱类，13 个萜类化合物，11 个黄酮类化合物。其中，来源于防己的有7 个，茯苓有6 个，黄芪有9 个，甘草有11 个，桂枝有1 个，且大部分化合物都是各自中药的特征成分。但是来源于桂枝的较少，可能与其主要成分是挥发油有关。另外，质谱解析过程中也存在大量同分异构体，在无对照品的支撑下无法确定，需要其他手段进一步深入研究。本试验运用HPLC-Q-TOF-MS/MS 技术方法，对复方防己茯苓汤的主要化学成分进行了详细研究，这对复方的质量控制及药效物质基础的进一步研究具有重要意义。