包载姜黄素的羧甲基化白及多糖-壳聚糖聚电解质复合膜对大鼠口腔溃疡的治疗作用研究

王玉蓉，巨佳，王济，赵慧雯，林瑶，黄静，薛晓娟，冯斌，成黎霏*（.军事口腔医学国家重点实验室，国家口腔疾病临床医学研究中心，陕西省口腔生物工程技术研究中心，第四军医大学口腔医院 药剂科，西安70032；2.陕西中医药大学，陕西 咸阳 72046）

口腔溃疡属于中医中口疡、口疮的范畴[1]，是一种常发生于口腔黏膜的溃疡性损伤病症，通常具有自发性和复发性[2]。口腔溃疡会导致疼痛，严重影响患者饮食和说话，降低患者的生活质量[3-4]。

姜黄素（curcumin，Cur）是从姜科植物姜黄的干燥根茎中提取的主要有效成分。研究发现其具有抗炎、抗病毒、抗感染等药理活性，且不良反应少[5]。近几年有研究表明Cur 对口腔疾病牙周炎[6]和口腔溃疡[7]等有显著效果。但因其几乎不溶于水，生物利用度低，限制了其临床应用。

本课题组前期采用生物可降解性的白及多糖（Bletilla striatapolysaccharide，BSP）和壳聚糖（chitosan，CS）为原材料，通过醚化法[8]对BSP进行羧甲基化改性，改性后的BSP 与带正电的CS 通过静电作用[9]形成聚电解质复合物，制备了用于治疗口腔溃疡的载有Cur 的羧甲基化白及多糖-壳聚糖（CMBSP-CS）聚电解质复合膜。

本研究采用冰醋酸灼伤化学方法[10]建立大鼠口腔溃疡模型，通过HE 染色法考察前期制备的包载Cur 的CMBSP-CS 载药聚电解质复合膜[11]对大鼠口腔溃疡愈合的影响，通过ELISA法检测各组大鼠血清和组织中TNF-α、IL-6、IL-1β含量的变化，以期明确CMBSP-CS 对大鼠口腔溃疡的治疗作用及其可能的作用机制，为该制剂的应用研发提供依据。

1 材料

1.1 实验动物

SPF 级雄性SD 大鼠72 只，体质量（200±20）g [第四军医大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK（军）2012-0007]。

1.2 试药

包载Cur 的CMBSP-CS 载药聚电解质复合膜[实验室自制，平均厚度为（74.0±2.0）μm，载药量为95.41%，体外累积释放度可达93.78%]，空白膜（实验室自制）；大鼠TNF-αELISA 试剂盒（F18960）、IL-6 ELISA 试剂盒（F1887）、IL-1βELISA 试剂盒（F1917）、BCA 试剂盒（W1117）（上海西唐生物科技有限公司）；山羊封闭血清（中杉金桥）；Triton（Sigma 公司）；NP-40 裂解液、P0413F（上海碧云天）；醋酸（批号：190522，富宇精细化工）；生理盐水（批号：190506，山东科伦）；水为纯化水（实验室自制）；水合氯醛、多聚甲醛（国药集团化学试剂有限公司）。

1.3 仪器

DW-86L386－80℃超低温冰箱（海尔）；Leica RM2125RTS 石蜡切片机（德国徕卡）；AX-84 光学显微镜（日本Olympus）；DENLEY DRAGON Wellscan MK3 酶标仪、Wellwash 4 MK2洗板机（芬兰Thermo）；PYX-DHS，4002×500数字显示隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）；TGL-168、11-07 离心机（上海安亭科学仪器厂）；20 ～200 μL 移液枪（Thermo labsystems）；XW-80A 漩涡混合器（上海青浦沪西仪器厂）；DHG-9023A 电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；0.1 ～50 mL 连续分液器（TOMOS LIFE SCIENCE Group）；高通量组织研磨器（宁波新芝）。

2 方法

2.1 动物模型的建立

将72 只雄性大鼠放在昼夜交替、温湿度分别为（24±2）℃和40%～60%的房间适应性饲养1 周后称重，随机分成正常组、模型组、空白膜组和药膜组，每组18 只。模型组、空白膜组和药膜组用 10%水合氯醛溶液按照0.3 mL/100 g腹腔注射给药用于麻醉，将直径为 5 mm 的脱脂棉球塞入内径为0.5 cm 的移液枪枪头中，用50 μL 50%醋酸溶液浸润后垂直紧贴于大鼠下唇口腔黏膜表面处，持续按压 60 s 后移除棉球并用 5 mL 生理盐水连续冲洗，以此建立大鼠口腔溃疡模型。正常组则使用生理盐水代替，其余操作不变。造模 24 h 后，观察大鼠造模区局部黏膜的情况，如果形成约为0.5 cm 的溃疡，且周围有充血、红肿和假膜则表明溃疡成功形成[12-13]。

2.2 给药方法

大鼠在给药前，采用10% 的水合氯醛腹腔麻醉，将空白复合膜与CMBSP-CS 载药聚电解质复合膜裁剪为0.5 cm2大小备用，给药时贴于大鼠口腔溃疡患处，轻压20 s 以保证膜剂与患处贴合紧密。造模成功当日开始给药，每日给药一次，连续给药7 d。正常组与模型组麻醉后不做处理。用药后2 h 内禁食禁水，其余时间自由进食进水[12]。

2.3 大体观察

造模成功后观察动物外观、精神及一般状况的变化，肉眼观察各组溃疡愈合程度，每日测量并记录大鼠体质量的变化。

2.4 大鼠溃疡局部组织和血清中 TNF-α、IL-1β、IL-6 含量测定

各组于造模成功后第3日和第7日各随机选取6 只动物眼眶取血后处死。待血液凝固后，4000 r·min－1离心5 min，分离血清，分装保存于－80℃备用。药膜组、空白膜组和模型组切取溃疡组织黏膜，正常组切取正常黏膜，用预冷的生理盐水冲洗组织以去除残留血液，将黏膜剪碎后置于 EP 管中称重后加入NP-40 裂解液，用细胞超微粉碎机对黏膜进行充分粉碎。将粉碎得到的组织匀浆置于高速离心机中4℃、5000 r·min－1离心20 min 后用移液器移取上清液后分装保存于－80℃冰箱中备用，按 ELISA 试剂盒说明书操作进行上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6含量的测定。

2.5 溃疡组织病理学观察

各组于造模成功后第3日与第7日各随机选取3 只大鼠处死取得黏膜标本后，将黏膜标本用生理盐水冲洗干净后立即放入 4%多聚甲醛溶液进行固定，用石蜡对组织进行包埋后，连续4 μm切片，HE 染色，然后在光学显微镜下观察分析。

2.6 统计分析

应用SPSS 19.0 软件进行统计分析。数据均以±s表示，两两比较采用 LSD-t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。Sigma Plot 12.5 软件作出图像分析。

3 结果

3.1 CMBSP-CS 载药聚电解质复合膜对口腔溃疡愈合的作用

3.1.1 大体观察 对大鼠精神状况、毛发和运动的观察采用盲法进行，观察结果显示，正常组大鼠反应灵敏，背毛光泽，二便和活动正常；模型组大鼠反应迟钝，口唇边潮湿，流口水，毛发粗糙分叉，大便偏稀；给药组反应灵敏，背毛光泽，活动正常。

3.1.2 体质量变化 造模第3日，与正常组比较，模型组、药膜组与空白膜组大鼠体质量变化显著降低（P＜0.05）；与模型组相比，药膜组体质量变化显著升高（P＜0.05）。说明醋酸处理使大鼠产生疼痛与不适导致了大鼠体质量下降，给予一次药膜能够减少大鼠的体质量下降。

第4日，与模型组相比，药膜组大鼠体质量变化显著升高（P＜ 0.05），与正常组相比差异无统计学意义。结果提示，给予两次药膜处理能够使大鼠体质量变化恢复到正常水平。第5日，与模型组相比，空白膜组大鼠体质量变化有显著上升趋势，与正常组相比差异无统计学意义（P＜0.05）。

第6 ～8日，各组大鼠体质量间差异均无统计学意义，提示实验开始6 d 后口腔溃疡对大鼠体质量的影响消失（见图1）。

3.1.3 创面愈合情况 成功建模后第 3、5、7日分别观察各组大鼠口腔溃疡情况（观察前用纯净水冲洗各组溃疡处，去除药膜等残留物以便观察）。结果显示，正常大鼠各时间点口腔黏膜表面光滑，无水肿，无充血现象（见图2A ～C）；建模后第3日，模型组、空白膜组和药膜组造模区黏膜水肿，形成黄白色假膜（见图2D、G、J）。建模后第 5日，空白膜组黄白色假膜变薄（见图2H）；药膜组黄白色假膜已经完全脱落，肿胀程度减轻，组织周围充血减轻（见图2K）；建模后第7日，模型组黄白色假膜未完全脱落（见图2F）；空白膜组黄白色假膜完全脱落（见图2I）；药膜组有明显的愈合现象，肿胀现象基本消失，周围组织充血消失（见图2L）。结果表明，药膜组口腔溃疡愈合速度最快，说明载药复合膜治疗能够明显加速口腔溃疡的愈合；其次为空白膜组，说明膜材中的CMBSP-CS 对口腔溃疡的愈合有一定的促进作用；最后为模型组，验证了口腔溃疡具有自愈性。

图2 不同处理组大鼠口腔溃疡发展过程Fig 2 Development of oral ulcers in rats in different treatment groups

3.2 组织病理学观察

由图3可知，正常组大鼠口腔黏膜上皮完整连续，无血管充血和炎性细胞浸润等病理改变（见图3A、B）。造模成功后第3日，除正常组外，其余各组大鼠黏膜皮层、棘层、基底层均破坏消失，固有层直接暴露，细胞出现空泡变性，溃疡部位有大量的炎性细胞浸润，同时有少量的红细胞外渗（见图3C、E、G）；第7日，模型组基底细胞层开始呈现修复反应，但炎性细胞浸润依旧明显（见图3D）；空白膜组有新的肉芽组织产生，但仍有明显的炎性细胞浸润（见图3F）；药膜组溃疡部位棘层、基底层逐渐修复，炎症细胞浸润明显减少，黏膜组织结构趋于完整（见图3H）。结果表明，药膜组口腔溃疡愈合速度最快，其次为空白膜组，说明载药复合膜治疗能够明显加速口腔溃疡的愈合，膜材中的CMBSP-CS 对口腔溃疡的愈合也有一定的促进作用。

图3 口腔黏膜 HE 染色图片（100×，n ＝3）Fig 3 HE staining picture of oral mucosa（100×，n ＝3）

3.3 大鼠口腔溃疡组织和血清中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6 的检测

由图4可知，造模成功后第3日，与正常组相比，模型组、空白膜组、药膜组口腔溃疡组织和血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量显著增加（P＜0.05）造模成功后第7日，与正常组相比，模型组、空白膜组、药膜组口腔溃疡组织和血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量仍显著增加（P＜0.05），但与第3日比较含量有所下降；与模型组相比，药膜组与空白膜组口腔溃疡组织和血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量显著下降（P＜0.05），其中药膜组效果显著优于空白膜组（P＜0.05）。结果显示，给予6 次药膜处理对大鼠溃疡组织和血清中 TNF-α、IL-1β、IL-6 含量减少的影响最为显著，其次为空白膜组，最后是模型组，结果也表明口腔溃疡具有自愈性。

图4 大鼠口腔溃疡组织和血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量（± s，n ＝6）Fig 4 Content of TNF-α、IL-1β、IL-6 in rat oral ulcer tissue and serum（± s，n ＝6）

4 讨论

本研究以醋酸化学灼伤建立的创伤性口腔溃疡大鼠模型为实验对象，通过大体观察、创面愈合情况及组织病理学观察评价CMBSP-CS 载药聚电解质复合膜与空白膜对口腔溃疡的治疗作用，研究结果显示CMBSP-CS 载药复合膜及空白膜对口腔溃疡均有一定的治疗作用，载药复合膜的效果最为明显，说明空白膜可以协同Cur 一同起到治疗口腔溃疡的作用，载药复合膜是一个药辅合一的制剂，具有很高的临床应用价值。研究中观察到CMBSP-CS 载药聚电解质复合膜能够减少口腔溃疡大鼠的体质量下降，推测载药复合膜可能产生了一定的镇痛效果，Cur 是中药姜黄中的有效成分之一，《中国药典》中记载：“姜黄可用于胸胁剌痛，闭经，徵瘕，风湿肩臂疼痛，跌扑肿痛”。说明可能与Cur 的镇痛作用有关；多次给予空白复合膜能够使大鼠体质量变化恢复到正常水平，这可能与膜材中CMBSP-CS 的抗炎、抗菌作用及CS 提高免疫力等作用有关。

本研究还通过大鼠口腔溃疡组织和血清中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的检测对CMBSP-CS载药聚电解质复合膜的口腔溃疡治疗作用机制进行了初步探索，结果表明CMBSP-CS 载药聚电解质复合膜可明显降低口腔溃疡组织中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平[14-18]，从而减少炎症的发生，但是其分子免疫机制和对口腔溃疡中其他因子的影响尚不清楚。下一步课题组将围绕其是否具有镇痛作用及具体的作用机制继续进行研究。