褪黑素联合紫杉醇对卵巢癌SKOV3细胞增殖抑制及凋亡作用的相关机制研究

朱雯婷，陈亦清，刘晓敏，洪晔，袁中文，刘圣曜（.广州医科大学附属第三医院药学部，广州5050；2.广州医科大学附属第二医院骨科，广州 50260）

卵巢癌是一种高死亡率的妇科肿瘤，严重威胁妇女的健康。目前卵巢癌的一线化疗药物主要有紫杉醇（paclitaxel，PTX）和顺铂，这些药物具有较好的抗肿瘤活性，但是对正常组织有一定的毒副作用，且易产生耐药[1]。因此，联合其他药物治疗卵巢癌可能是一种新的有效手段。

褪黑素（melatonin，Mel）是一种主要由松果体产生的激素，可用于治疗多种疾病，包括神经退行性疾病、癌症、病毒感染等[2-3]。褪黑素对于乳腺癌、膀胱癌、结直肠癌、宫颈癌等具有细胞毒作用，特别是对激素依赖性肿瘤具有重要作用[4-5]。可能与其作用多种信号通路相关，例如Akt/mTOR 通路，增加活性氧的产生，线粒体或内质网应激效应等[6-7]。新的研究表明，褪黑素联合化疗药物可以增强药物抗肿瘤效果[8]。但褪黑素是否能增强紫杉醇对卵巢癌的化疗效果至今未见报道。因此，探讨褪黑素联合紫杉醇体内外治疗卵巢癌的作用有重要的临床意义。

1 材料

褪黑素（纯度＞95%，MB1475）、紫杉醇（MB1178）（大连美仑生物技术公司）。Bax 抗体（50599-2-lg）、Bcl-2（12789-1-AP）兔抗人单克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司），Ki-67 兔抗人单克隆抗体（ab16667，Abcam 公司）。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔抗人单克隆抗体（AB-P-R001，杭州贤致生物），辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）标记山羊抗兔IgG（CW0103，康为世纪公司），细胞凋亡检测试剂盒（C1062M）、Hoechst 33258 染色液（C1017）、BCA 试剂盒（P0012S）（上海碧云天生物科技有限公司）。

人卵巢癌细胞株SKOV3 细胞（广州医科大学附属第三医院）用含有10%胎牛血清的DMEM 高糖培养基，于37℃、5%CO2培养箱中培养。6 ～8周雌性BALB/c 裸鼠20 只，体质量18 ～20 g[珠海百试通生物科技有限公司，动物合格证号：SCXK（粤）2020-0051]。

倒置荧光显微镜（TE2000-S）、正置荧光显微镜（Ni-u）（日本尼康公司），活细胞显微激光扫描成像系统（A1，日本尼康公司），凝胶成像系统（Bio-Rad Model 680），流式细胞仪（Thermo Fisher，Life Science）。

2 方法

2.1 细胞增殖和形态观察

用不同浓度的紫杉醇或褪黑素联合紫杉醇作用于SKOV3 细胞，处理48 h 后，使用倒置荧光显微镜观察细胞形态，并通过噻唑蓝（MTT）法检测细胞存活率，在490 nm 波长处测定吸光度值。

通过细胞克隆实验检测褪黑素联合紫杉醇对SKOV3 细胞增殖的影响，SKOV3 细胞接种于6 孔板中，密度为1×103个/孔。实验分成4 组，分别为空白组，褪黑素（200 μg·mL－1）组，紫杉醇（20 μg·mL－1）组，褪黑素（200 μg·mL－1）联合紫杉醇（20 μg·mL－1）处理组，每孔药液量为2 mL。7 d 后，用结晶紫对形成的集落进行染色并定量。

2.2 细胞凋亡检测

用流式细胞仪和Hochest 33258 染色检测药物对SKOV3 细胞凋亡的影响。将1×104个/孔SKOV3 细胞接种于6 孔板中（Hochest 33258 染色实验取洁净盖玻片置于6 孔板），分别用单独的褪黑素（200 μg·mL－1）、紫杉醇（20 μg·mL－1）或两药联合处理48 h。

流式检测细胞凋亡实验参考细胞凋亡检测试剂盒进行如下操作：48 h 后将细胞消化并离心收集，用PBS 洗涤细胞两遍，加入195 μL Annexin V-FITC 结合液轻轻重悬细胞，加入5 μL Annexin V-FITC 轻轻混匀，加入10 μL 碘化丙啶染色液轻轻混匀，室温孵育20 min 后，上机进行检测。

Hoechst 33258 染色实验进行如下操作：在6孔板中加入0.5 mL 的固定液固定10 min，用PBS洗3 遍，加入0.5 mL Hoechst 33258 染色液染色5 min，再用PBS 洗3 遍，每次3 min，在载玻片上滴一滴抗荧光淬灭封片液，盖上贴有细胞的盖玻片，用活细胞显微激光扫描成像系统进行观察。

2.3 蛋白质印迹分析

药物处理后的SKOV3 细胞用含蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液裂解30 min 提取蛋白，BCA 试剂盒进行蛋白浓度测定。上样后用SDS-PAGE 胶分离、转膜。使用5%的牛奶进行封闭，用不同一抗4℃孵育过夜（GAPDH，稀释比例1∶2000，Bax 稀释比例1∶1000，Bcl-2 稀释比例1∶1000），TBST洗涤3 次，然后在室温下孵育HRP 标记山羊抗兔IgG 的二抗（稀释比例1∶5000），最后在PVDF 膜上滴加Ecl 发光液（Millipore，USA）用凝胶成像系统进行显影。

2.4 体内抗肿瘤作用

在BALB/c 裸鼠右背部皮下注射100 µL SKOV3 细胞悬液（5×106个）和100 µL 基质胶混合液。约10 d 后，当肿瘤体积大于100 mm3时，将裸鼠随机分为4 组，分别接受生理盐水，褪黑素（25 mg·kg－1），紫杉醇（20 mg·kg－1），褪黑素与紫杉醇联合腹腔注射给药。每两日给药一次，并测量肿瘤的体积，肿瘤体积的计算公式＝长×宽2/2，给药6 次后，处死裸鼠收集肿瘤组织称重，并拍照。

将石蜡包埋的肿瘤切片脱蜡至水，苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-Eosin staining，HE）观察肿瘤组织形态和结构。染色后，在正置荧光显微镜随机取不同的视野拍照。

2.5 免疫组化

肿瘤切片脱蜡至水，用pH 6.0 的柠檬酸缓冲液在90℃热修复30 min，冷却至室温，参考兔/鼠通用型Streptavidin-HRP 试剂盒（CW2069，康为世纪）说明书步骤如下：切片用内源性过氧化物酶封闭液室温孵育10 min，PBS 充分洗涤，羊血清室温孵育10 min，甩干后用一抗（Ki-67 稀释比例1∶200）4℃下孵育过夜，PBS 洗3 遍，每次3 min。然后在室温下与生物素标记羊抗兔/鼠二抗工作液孵育10 min，再滴加适量HRP 标记的链霉亲和素，室温孵育10 min，最后，加适量的二氨基联苯胺（Dia minobenzidine，DAB）显色工作液染色3 min。脱水透明封片在正置荧光显微镜，随机取3 个视野进行拍照。

2.6 TUNEL 荧光法染色

肿瘤石蜡切片脱蜡至水。参考原位末端转移酶标记技术（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，TUNEL）一步法细胞凋亡检测试剂盒（KGA7071，凯基生物）说明书步骤如下：用Proteinase K 工作液在37℃反应30 min，PBS 漂洗3 次。放入湿盒中，每张切片滴加配制好的TdT 酶反应液，37℃处理45 min，再用PBS 漂洗3 次。每个样本上滴加 50 μL Streptavidin-FITC 标记液，37℃避光反应 30 min，最后用含DAPI 染色液的抗荧光淬灭封片，在活细胞显微激光扫描成像系统观察细胞凋亡。

2.7 统计分析

使用SPSS 17.0 软件进行统计分析。数据采用平均值±标准差表示。对各组数据进行方差齐性检验，方差齐，多组均数间比较采用单因素方差分析，组间比较用LSD 法，P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 褪黑素联合紫杉醇对SKOV3 细胞的增殖的抑制作用

褪黑素联合紫杉醇对卵巢癌SKOV3 细胞的毒性结果，如图1A 所示，用200 μg·mL－1的褪黑素处理SKOV3 细胞48 h，细胞形态正常，而褪黑素与20 μg·mL－1紫杉醇联合处理48 h 后，细胞形态发生变化，且细胞数量显著减少。紫杉醇对细胞的毒性具有浓度依赖性，通过SPSS 软件非线性回归拟合计算得出，紫杉醇作用48 h 的IC50为28 μg·mL－1，而用200 μg·mL－1褪黑素联合不同浓度的紫杉醇会增加对SKOV3 细胞的细胞毒性，IC50降为13.46 μg·mL－1，差异有统计学意义（P＜0.05）（见图1C）。

细胞克隆实验验证褪黑素联合紫杉醇对卵巢癌细胞增殖的影响，结果如图1B 所示。与紫杉醇单药处理组相比，褪黑素联合紫杉醇处理组能明显减少人卵巢癌细胞SKOV3 的克隆集落数，计算每组克隆集落数，如图1D 所示，褪黑素联合紫杉醇组克隆集落数显著低于褪黑素单药组（P＜0.001），紫杉醇单药组（P＜0.05），说明两药联合能更好地抑制SKOV3 细胞增殖。

图1 褪黑素联合紫杉醇对卵巢癌SKOV3 细胞增殖的影响Fig 1 Effect of melatonin combined with paclitaxel on proliferation of ovarian cancer SKOV3 cells

3.2 褪黑素联合紫杉醇诱导卵巢癌SKOV3 细胞凋亡作用

褪黑素和紫杉醇对SKOV3 细胞凋亡的影响结果见图2。图2A 显示空白未处理组的凋亡率仅为（3.19±0.43）%，褪黑素处理48 h 后，凋亡率为（5.36±0.90）%，紫杉醇组的凋亡率为（14.99±1.41）%，褪黑素和紫杉醇联合使用时的细胞凋亡率约为（26.5±2.12）%，与单药物组相比差异有统计学意义（见图2C，P＜0.01，P＜0.001）。此外，Hoechst 33258 染色结果显示，在两药联合药物处理组中，细胞核出现明显的固缩，或呈碎块状，说明两药联合能明显增加细胞的凋亡。Bax 和Bcl-2是凋亡途径中的重要蛋白，如图2D 所示，褪黑素和紫杉醇联合处理组中Bcl-2/Bax 的比例与空白组和单药处理组相比明显更低。

图2 褪黑素联合紫杉醇对卵巢癌SKOV3 细胞凋亡的影响Fig 2 Effect of melatonin combined with paclitaxel on apoptosis of ovarian cancer SKOV3 cells

3.3 褪黑素联合紫杉醇对移植瘤的抑制作用

SKOV3 移植瘤裸鼠模型观察褪黑素联合紫杉醇的体内抗肿瘤作用。图3A 肿瘤的生长曲线的结果显示，两药联合组的肿瘤生长缓慢，显示出较强的抗肿瘤效果。与单药组相比，差异有统计学意义。图3B 是给药结束后每组取出的肿瘤组织的代表图，紫杉醇组的肿瘤体积小于生理盐水组，而两药联合组的体积明显小于紫杉醇组。将各组的肿瘤组织取出来进行称重，瘤重结果如图3C 所示，褪黑素联合紫杉醇组的质量小于褪黑素组单药组[（0.148±0.02 g）vs（0.717±0.06）g，P＜0.001]和紫杉醇单药组[（0.148±0.02 g）vs（0.308±0.07）g，P＜0.01]。图3D 中肿瘤组织的HE 染色结果表明，生理盐水组中的肿瘤细胞成簇生长，并且结构紧凑且正常，褪黑素和紫杉醇单药组显示局部缺血和缺氧坏死，而联合治疗组的缺血性坏死部分更大。

图3 褪黑素联合紫杉醇在SKOV3 移植瘤模型中的抗肿瘤作用Fig 3 Anti tumor effect of melatonin combined with paclitaxel on SKOV3 xenograft tumor model

3.4 褪黑素联合紫杉醇对移植瘤Ki-67 与瘤组织细胞凋亡的影响

药物对荷瘤裸鼠肿瘤细胞增殖情况的影响如图4A 所示。生理盐水组肿瘤组织Ki-67 的表达水平最高（81.6±6.8）%，紫杉醇治疗组Ki-67 表达下降，而褪黑素联合紫杉醇组Ki67 阳性细胞数（20.3±4.5）%明显低于褪黑素单药组（60.3±7.1）%（P＜0.001）和紫杉醇单药处理组（31.0±2.6）%（P＜0.05）（见图4B），表明两药联合对细胞增殖的抑制作用强于单药治疗组。

图4 Ki-67 染色检测褪黑素联合紫杉醇对卵巢癌SKOV3 移植瘤模型细胞增殖的影响（40×）Fig 4 Effect of melatonin combined with paclitaxel on the proliferation of SKOV3 cells detected by Ki-67 staining（40×）

TUNEL 染色检测药物作用后对裸鼠肿瘤组织细胞凋亡的影响。如图5所示，生理盐水组和褪黑素组几乎没有绿色荧光点的存在，而紫杉醇组和褪黑素联合紫杉醇治疗组绿色荧光明显增多，且两药联合组的荧光明显强于紫杉醇单药治疗组，表明褪黑素的加入可以明显增强紫杉醇引起的细胞凋亡。

图5 TUNEL 染色检测褪黑素联合紫杉醇对卵巢癌SKOV3 移植瘤模型细胞凋亡的影响（20×）Fig 5 Effect of melatonin combined with paclitaxel on the proliferation of SKOV3 cells detected by TUNEL staining（20×）

4 讨论

褪黑素在多种癌症具有显著的抑制作用。褪黑素可抑制肿瘤有氧糖酵解、细胞增殖、转移相关的细胞信号通路，并克服了肿瘤的多药耐药[9-11]。例如，褪黑素可通过降低组蛋白脱乙酰基酶9 的表达来抑制非小细胞肺癌的生长并促进细胞凋亡[12]；通过下调ZNF746 调节的MMP-9/MMP-2 通路来抑制膀胱癌的增殖、迁移和侵袭[13]。

实验表明在联合给药组中SKOV3 卵巢癌细胞的增殖被显著抑制，Ki-67 的阳性率低于单药组。因此，可以推断两种药物的联合可以起到抑制肿瘤增殖的协同作用。此外，联合给药可显著诱导卵巢癌SKOV3 细胞凋亡。Bcl-2 是一种膜蛋白，主要位于线粒体的外膜上，诱导caspase-3/-9的释放。该家族中的蛋白表现出促凋亡或抗凋亡活性，其中Bcl-2/Bax 比值可作为确定细胞凋亡易感性的标志物[14]。本研究发现褪黑素联合紫杉醇通过在体外下调Bcl-2/Bax 比值来诱导卵巢癌细胞凋亡。体内TUNEL 染色结果进一步说明褪黑素增强了紫杉醇对卵巢癌细胞的促凋亡作用。

研究发现，褪黑素和化疗药物的联合不仅能极大地增强药物对肿瘤细胞的疗效，而且可以降低化疗的副作用[15]。例如，化学疗法引起的神经性疼痛是癌症治疗中常见的毒副作用，褪黑素作为一种有效抗氧化剂可通过降低氧化应激，减少由化疗药物紫杉醇引起的线粒体损伤和神经性疼痛[16]。综上所述，褪黑素一种安全有效的化疗增敏剂，与紫杉醇的联合疗法具有良好的临床应用前景。