92种工业染料在四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱中的离子化规律

李露青，李 双，王春芳，洪梦蓉，方科益，陈树兵∗，曹国洲，韩 超，王传现

(1．宁波海关技术中心,宁波315040; 2．宁波中盛产品检测有限公司,宁波315040;3．浙江树人大学 生物与环境工程学院,杭州310015; 4．上海海关 动植物与食品检验检疫技术中心,上海200135)

食品中工业染料的超量和超种类滥用是目前食品安全面临的重大问题之一。工业染料因色彩鲜亮,不易褪色且价格低廉等特点而被不法商贩青睐[1]。工业染料不仅不能为人体提供营养物质,反而会危害身体健康,甚至诱发癌变,在食品中违法添加工业染料是国家严厉打击的行为[2-4]。高效液相色谱法(HPLC)、超高效液相色谱法(UPLC)和液相色谱-三重四极杆质谱法是目前工业染料的主流分析方法[1,5-13]。食品中工业染料分子离子峰的准确确定是保证待测化合物被准确筛查的重要前提,但是关于不同种类工业染料离子化规律和分子离子峰的存在形式的研究较少。其中,液相色谱法不仅难以满足复杂食品基质中低限量检测要求,还不能提供任何目标物的质量信息,极易产生假阳性结果。质谱分析可提供丰富的结构信息,同时具备高特异性和高灵敏度,通过二级碎片离子可实现已知化合物的准确定性,随着质谱仪的发展和推广,一次分析检测完成多个或多类目标物的分析已成为可能,对工业染料进行的检测也逐渐由用三重四极杆质谱的目标型检测向用高分辨质谱(HRMS)的精确质量非目标型全扫描检测转变[14-15]。全扫描高分辨质谱仪与常规三重四极杆质谱仪的区别在于,它不需要已知待测化合物的特征离子碎片,而是直接采用高分辨率(在m/z200时,分辨率不小于70 000)和高准确度质量数(质量数误差不大于1×10－6)对待测样品进行定向或非定向扫描,大大降低了共洗脱的相似质量数的干扰,极大地避免了假阳性结果的产生。

本工作采用四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪对92种工业染料的离子化规律进行了研究,为工业染料的快速鉴定提供依据。

1 试验部分

1．1 仪器与试剂

Q-Exactive型四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪,配电喷雾离子(ESI)源;Milli-Q 型超纯水发生器。

标准溶液:10 mg·L－1,分别称取适量92种工业染料标准品,用含5 mmol·L－1甲酸铵的乙腈溶液稀释成10 mg·L－1的标准溶液,于4 ℃避光保存。其中,苏丹红Ⅳ用二氯甲烷溶解,乙腈定容;其余31种酸性染料用水溶解,乙腈定容。

92种工业染料纯度不小于95%;乙腈、甲酸铵和二氯甲烷均为色谱纯;试验用水为超纯水(18．2 MΩ·cm)。

1．2 仪器工作条件

在样品运行前先对仪器分别进行正/负离子校正;正/负离子转换模式;一级全扫描范围:m/z50～800;分辨率70 000(m/z200),自动增益控制(AGC)目标值5×105;离子源电压为2 700 V(ESI－)和3 500 V(ESI＋);碰撞诱导裂解(CID)能量为10～50 e V;离子传输管温度为300 ℃;鞘气为氮气,压力为5 L·h－1;辅助气为氮气,压力为5 L·h－1;气化室温度为80 ℃;二级质谱分辨率为35,000;AGC 目标值为2×105,碰撞能量范围为20～40 eV。注射泵直接进样,流量为10 μL·min－1。

1．3 试验方法

对配制好的10 mg·L－192种工业染料标准溶液通过直接进样的方式,按照仪器工作条件进行分析。

2 结果与讨论

2．1 分子离子峰的确定

通常选择一级质谱中既能代表化合物结构信息,强度又比较高的母离子作为准分子离子峰对待测样品进行快速筛查,按照仪器工作条件对92种工业染料标准溶液进行分析,通过比较正负离子模式下的响应强度,确定每种染料的最佳电离方式和分子离子峰的存在形式,92种工业染料的最佳电离方式、分子离子峰的存在形式和基峰m/z见表1。

表1 92种工业染料的最佳电离方式、分子离子峰的存在形式和基峰m/zTab．1 The optimum ionization modes，molecular ion peaks and m/z values of the base peaks of the 92 industrial dyestuffs

表1(续)

表1(续)

由表1可知:苏丹染料和分散染料等含电负性偶氮基团的弱极性染料,容易在ESI＋模式下形成[∗M＋H]＋;酸性和碱性染料的最佳电离模式分别为ESI－和ESI＋,但由于两者分子结构中所含官能团的差异,其分子离子峰存在形式比较复杂,且存在较大差异。

2．2 碱性染料分子离子峰存在形式的讨论

多数碱性染料分子式中含有氯元素,氯元素的存在状态决定了分子离子峰的存在形式。典型的几种存在形式见图1。

由图1可知:当氯元素是以卤化氢的形式存在时,去掉一个卤化氢后,剩下的部分形成了准分子离子峰,通过提取[∗M＋H]＋的质量数即可进行定性和定量分析(∗M 为脱盐酸后的中性分子),例如:碱性红1[图1(a)];当氯元素是以Cl－的形式存在时,含有强极性基团(分子中氮原子呈现带有4个键的正离子状态)的碱性染料是通过丢掉Cl－形成分子离子峰,可直接通过提取[∗M]＋的质量数进行定性和定量分析(∗M 为丢掉Cl－后形成的分子离子峰),这也是碱性染料分子离子峰的主要存在形式。对于含有硫元素的碱性染料,当硫元素是以HSO4－的形式存在时,含有强极性基团(分子中氮原子呈现带有4个键的正离子状态)的碱性染料是通过丢掉HSO4－形成分子离子峰,可直接通过提取[∗M]＋的精确质量数进行定性和定量分析(∗M为丢掉HSO4－后形成的分子离子峰),例如:碱性绿1[图1(b)]和碱性蓝9[图1(c)],其中,碱性蓝9比较特殊,除含Cl－外,还含有水分子和硫元素;但是硫元素并不是以HSO4－的形式存在,提取准分子离子峰时不需要考虑。对于含水合物的工业染料,是通过丢掉水分子形成的准分子离子峰进行分析的,例如:碱性蓝9[图1(c)],是通过提取[∗MH2O]＋的质量数进行定性和定量分析(∗M 为脱Cl－后形成的分子离子峰)。小部分不含有氯元素和硫元素的碱性染料形成的分子离子峰和弱极性染料的类似,可直接通过提取[M＋H]＋的质量数进行定性和定量分析,例如:结晶紫内酯[图1(d)]。

图1 不同碱性染料中分子离子峰的存在形式Fig．1 Existing forms of molecular ion peaks of various basic dyestuffs

2．3 酸性染料分子离子峰存在形式的讨论

酸性染料分子中均含有1个或多个水溶性的磺酸基,属于强极性的阴离子染料,极易溶于水电离生成阴离子,在ESI－模式下进行检测,母离子一般为[M-Na]－,然而试验发现有15 种酸性染料都是以多种价态离子共存,形成的准分子离子峰的类型和信号强度与分子结构中Na＋、磺酸基的数目、氮或硫元素及卤素的存在状态有关,这些分子倾向失去所有Na＋,然后再从溶剂中获得氢原子结合在磺酸基上,在溶液中形成一系列[(M－xNa＋yH)/(xy)]－离子。

针对只含有单个Na＋的酸性染料,其典型的分子离子峰的存在形式见图2。

图2 酸性蓝1和甲基橙1的分子离子峰的存在形式Fig．2 Existing forms of molecular ion peaks of acid blue 1 and methyl orange

由图2可知:不管是含有强极性基团(分子中氮原子呈现带有4个键的正离子状态)且含有磺酸基(SO3－)数量为2[酸性蓝1,图2(a)]还是化合物中的所有氮元素均不是强极性基团(分子中氮原子呈现带有4个键的正离子状态)且含有磺酸根数量为1的酸性染料[甲基橙,图2(b)]均可通过直接提取准分子离子峰[∗M]－进行定性定量分析(∗M 为丢掉钠离子后形成的分子离子峰)。

含有2个或以上Na＋或者含有碘、溴等卤素离子且不含磺酸根的酸性染料的分子离子峰的存在形式见图3。

图3 酸性红27、橙G 和酸性红51的分子离子峰的存在形式Fig．3 Existing forms of molecular ion peaks of acid red 27,orange G and acid red 51

含有2个或以上Na＋,且具有同等数量的磺酸根的酸性染料化合物在ESI－模式下会形成一系列[(M－xNa＋yH)/(x－y)]－多离子共存的状态(其中∗M 为脱去所有Na＋后的带电离子),其中多以二价准分子离子为基峰,因为单价态和更高价态的分子离子峰响应较低,例如:酸性红27[图3(a)]。此类化合物(如:酸性红27)形成的分子离子峰的价态形式随着锥孔电压的增加而改变,在较低锥孔电压下容易形成一价和二价分子离子峰,但过低锥孔电压会影响待测化合物的响应值;增大锥孔电压时,则主要形成一价分子离子峰,但过高的锥孔电压会导致化合物发生碰撞诱导解离,虽然能产生较丰富的碎片离子,但也会降低准分子离子峰响应值;所以本工作将锥孔电压设定为20 eV。极性偏小的酸性染料容易行成二价准分子离子峰,例如:酸性红27[图3(a)]。极性偏大的酸性染料容易形成一价准分子离子峰,例如:橙G[图3(b)]。对于含有碘、溴等卤素离子的酸性染料,当此类化合物中不含有磺酸根时,在ESI－模式下会直接形成[∗M＋H]－(其中∗M 为脱去所有Na＋后的带电离子),例如:酸性红51[图3(c)]。

本工作采用四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪,对92种工业染料直接进行高分辨率和高准确度质量数(分辨率不小于70 000,m/z200)的正/负离子全扫描试验,获得92种工业染料的电离方式、准分子离子峰和基峰。在实际样品检测中,可通过直接提取一级质谱中准分子离子峰高准确度质量数对待测化合物进行快速筛查。