高效液相色谱法同时测定羚羊感冒片中7种活性成分的含量
2021-09-03张炜文戴文科
张炜文，戴文科
（1. 江苏省南通卫生高等职业技术学校，江苏 南通 226000；2. 宏冠生物药业有限公司，浙江 嘉兴 314500）
羚羊感冒片由羚羊角、淡豆豉、牛蒡子、桔梗、金银花、连翘、荆芥、淡竹叶、薄荷素油和甘草等10味药材制成，具有清热解表之功效，临床用于伴有发热恶风、头痛头晕、咳嗽、胸闷及咽喉肿痛等症候的流行性感冒疾病治疗[1]。方中连翘活性成分连翘酯苷A和连翘苷可能为连翘抑菌活性的有效成分[2]；甘草活性成分甘草酸具有抗过敏和抗炎作用，甘草苷具有免疫调节、抗炎、解痉等功效[3-4]；金银花具有清热解毒、宣散风热的功效，黄酮类化合物木犀草苷是其主要活性成分[5-6]。该药收载于《中华人民共和国药典》2020年版一部，标准中仅对牛蒡子的活性成分牛蒡苷做了定量检查要求，文献报道中[7-9]，研究标的至多针对羚羊感冒片中3味药材，作为其质控和评价方法显然不够全面。
中药制剂往往由几种或数十种药材制成，化学成分极其丰富，因此，中药制剂质量评价应具有系统性和全面化。本研究采用高效液相色谱（HPLC）波长切换法，同时测定羚羊感冒片中牛蒡苷、甘草苷、绿原酸、木犀草苷、连翘苷、连翘酯苷A和甘草酸铵7种组分的含量，方法简单、准确和实用，可为羚羊感冒片质量考察提供参考依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Waters 2695/2996型高效液相色谱仪，包括真空脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱，UV 2489检测器，Empower 2.0工作站（美国Waters公司）；AUW220D型电子天平（d=0.01 mg，日本岛津公司）；KQ-500E型医用超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
1.2 试药
羚羊感冒片（每片重0.3 2 g，批号分别为20180501，20180502，20180601，20180602，20180604，20180901，吉林济邦药业有限公司）；牛蒡苷对照品（批号：110819-201812，纯度：95.0 %），木犀草苷对照品（批号：111720-201609，纯度：94.9 %），连翘苷对照品（批号：110821-201816，纯度：95.1 %），绿原酸对照品（批号：110753-201817，纯度：96.8 %），甘草苷对照品（批号：111610-201607，纯度：93.1 %），连翘酯苷A对照品（批号：111810-201707，纯度：97.2 %），甘草酸铵对照品（批号：110731-201720，纯度：97.7 %，中国食品药品检定研究院）；甲醇、乙腈均为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 混合对照品溶液 精密称取牛蒡苷、甘草苷、连翘酯苷A、绿原酸、木犀草苷、连翘苷和甘草酸铵对照品各适量，加50 %甲醇制成每1 ml含牛蒡苷 0.175 mg、甘草苷0.068 mg、连翘苷 0.102 mg、绿原酸 0.110 mg、木犀草苷0.037 mg、连翘酯苷A 0.045 mg、甘草酸铵 0.048 mg的混合对照品溶液，混匀，滤过（0.45 μm），取续滤液，即得。
2.1.2 供试品溶液 取本品10片，除去包衣，研细，过筛（80目），取细粉约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50 %甲醇30 ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250 W，频率33 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用50 %甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过（0.45 μm），取续滤液，即得。
2.1.3 单味药材对照品溶液 按工艺方法分别取甘草、金银花、牛蒡子和连翘细粉（过80目筛）适量，按2.1.2项下方法制备，摇匀，滤过（0.45 μm），取续滤液，即得单味药材对照品溶液。
2.2 色谱条件[10-11]
色谱柱：Shim-pack GIST C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.05 %磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～10 min，12 %A；10～15 min，12 %A→18 %A；15～30 min，18 %A→25 %A；30～32 min，25 %A→36 %A；32～38 min，36 %A；38～46 min，36 %A→60 %A；46～60 min，60 %A→70 %A），后运行时间20 min；检测波长：0～16 min，328 nm（检测绿原酸、连翘酯苷A）；16～30 min，280 nm（检测连翘苷、牛蒡苷）；30～38 min，237 nm（检测甘草苷）；38～56 min，350 nm（检测木犀草苷）；56 min，245 nm（检测甘草酸铵）；进样量为10 μl；流速为1.0 ml/min；柱温为35 ℃。取2.1项下混合对照品溶液、供试品溶液及单味药材对照品溶液各10 μl，按上述色谱条件测定，结果见图1。理论板数按牛蒡苷、甘草苷、木犀草苷及甘草酸铵计均大于3500，供试品色谱图中各峰分离完全（分离度大于1.5），各目标色谱峰对称性良好（对称因子在0.94～1.16之间）。
图1 系统适用性试验HPLC图谱
2.3 线性关系考察
取2.1.1项下混合对照品溶液，分别精密吸取2，4，8，16，20，25，30，40 μl，注入液相色谱仪，按2.2项下色谱条件测定，记录色谱图。以对照品进样量X（μg）为横坐标，各组分峰面积Y为纵坐标，进行线性回归并绘制标准曲线，计算各组分回归方程及相关系数，结果见表1。结果表明7组分在各自线性范围内呈良好线性关系，该方法适用于定量检测要求。
表1 线性关系考察结果
2.4 精密度试验
取2.1.1项下混合对照品溶液适量，按2.2项下色谱条件，连续进样6针，记录各组分色谱图峰面积。结果牛蒡苷、甘草苷、绿原酸、木犀草苷、连翘苷、连翘酯苷A和甘草酸铵峰面积的RSD分别为0.1 %，0.4 %，0.2 %，1.3 %，0.8 %，1.2 %，0.6 %（n=6），表明仪器精密度良好。
2.5 稳定性试验
取同一批供试品（批号：20180501）溶液适量，分别放置0，3，6，10，15，20，24 h后，按2.2项下色谱条件测定，记录色谱图。结果牛蒡苷、甘草苷、绿原酸、木犀草苷、连翘苷、连翘酯苷A和甘草酸铵峰面积的RSD分别为0.8 %，0.9 %，0.6 %，1.6 %，1.2 %，1.4 %，1.0 %（n=7），表明24 h内供试品溶液稳定。
2.6 重复性试验
取同一批羚羊感冒片供试品（批号：20180501），除去包衣，研细，取细粉适量，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，平行制备6份，取续滤液适量，按2.2项下色谱条件测定，记录峰面积，计算各组分含量RSD值。结果6份样品中牛蒡苷、甘草苷、连翘苷、绿原酸、木犀草苷、连翘酯苷A和甘草酸铵的含量平均值分别为10.772，3.103，2.268，6.148，1.820，2.084，2.264 mg/g，含量RSD分别为0.5 %，0.8 %，1.0 %，0.6 %，1.0 %，0.9 %，0.6 %（n=6），表明方法重复性良好。
2.7 加样回收率试验
取已知含量羚羊感冒片（批号：20180501）20片，除去包衣，研细，取细粉约0.25 g，精密称定，同时称取6份，分别置具塞锥形瓶中，每瓶精密加入每1 ml含牛蒡苷 2.599 mg、甘草苷0.818 mg、连翘苷 1.368 mg、绿原酸 1.546 mg、木犀草苷0.453 mg、连翘酯苷A 0.502 mg和甘草酸铵 0.639 mg的混合对照品溶液1 ml，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.2项下色谱条件测定，记录峰面积，计算各组分的加样回收率及RSD值，见表2。
表2 7个组分的加样回收试验结果（n=6）
2.8 样品测定
取6批羚羊感冒片，按2.1.2项方法制备供试品溶液，按2.2项下色谱条件测定，记录各组分峰面积，按标准曲线法计算供试品中牛蒡苷、甘草苷、绿原酸、木犀草苷、连翘苷、连翘酯苷A和甘草酸铵的含量，结果见表3。
表3 羚羊感冒片中7种成分的含量（n=3，mg/g）
3 讨论
3.1 流动相的选择
本研究首先考察了甲醇-水及乙腈-水流动相系统，发现以甲醇-水作为流动相时，有个别目标化合物（甘草苷、木犀草苷和连翘酯苷A）无法检测，乙腈-水流动相系统色谱峰峰形较差，因此在水相中加入适量磷酸作为改性剂。结果当采用乙腈-0.05 %磷酸水溶液作为流动相时，各目标化合物分离度较好，且峰形对称，因7种目标化合物极性差异较大，使用梯度洗脱可大大节省检测时间，提高工作效率。
3.2 检测波长的选择
对7个组分采用DAD检测器在190～400 nm波长段进行光谱扫描，结果发现绿原酸特征吸收波长分别为217，240，328 nm，连翘苷和牛蒡苷在（280±2） nm处有最大吸收，木犀草苷特征吸收波长为253，350 nm，甘草苷特征吸收波长为237 nm，连翘酯苷A和甘草酸铵的特征吸收波长分别为328，245 nm，因各波长差异较大，本研究利用仪器波长自动切换功能，分段切换波长，使各目标化合物均在最大吸收波长处检测，提高试验准确度。检验波长设置为：0～16 min，328 nm（检测绿原酸、连翘酯苷A），16～30 min，280 nm（检测连翘苷、牛蒡苷），30～38 min，237 nm（检测甘草苷），38～56 min，350 nm（检测木犀草苷），56 min，245 nm（检测甘草酸铵）。
本研究采用HPLC法，同时测定羚羊感冒片中7种活性成分（牛蒡苷、甘草苷、绿原酸、木犀草苷、连翘苷、连翘酯苷A和甘草酸铵）含量，方法准确、简便、实用，能全面、准确地考察和评价羚羊感冒片的质量，为该药质量控制和药品监管提供技术支撑。
