阿胶中牛皮源成分补充检验方法的改进

鲁 辉，闵春艳，黄逸文，钱 岩，邢以文

（苏州市药品检验检测研究中心，江苏 苏州 215104）

阿胶为马科动物驴Equus asinusL.的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体胶，始载于《神农本草经》。阿胶作为药品使用已有2500多年的历史，《中国药典》（2020年版）一部中明确规定阿胶应以驴皮熬制[1]。近年，随着阿胶需求的迅猛增加，其原料驴皮也愈加紧俏，价格连连攀升，这就造成了不少企业为了降低生产成本在生产阿胶时以牛、猪等的皮熬制的胶类冒充阿胶或以动物骨、旧皮革等制成的伪品胶冒充阿胶[2-4]，此类行为极大损害了消费者的利益并影响人民群众的用药安全。为了有效控制阿胶药材的质量，国家食品药品监督管理局于2012年发布了“阿胶中牛皮源含量的补充检验方法”（标准编号2012001）[5]。此后，为了有效控制以阿胶为君药的中成药质量，国家食品药品监督管理总局又于2018年发布了阿胶补血膏（标准编号：BJY201804）[6]及阿胶补血口服液（标准编号：BJY201805）[7]中牛皮源成分检查项的补充检验方法。上述方法均以m/z641.3（双电荷）→726.2和m/z641.3（双电荷）→783.3提取的多反应监测（MRM）色谱峰作为牛皮源成分的特征肽段峰，并规定样品中不得同时检出；若同时检出，则要求样品中m/z641.3（双电荷）→726.2提取的MRM色谱峰面积不得超过对照溶液中相应的峰面积。上述补充检验方法结合《中国药典》（2020年版）一部品种项下相应标准作为日常监管手段，较好地控制了阿胶原药材及其中成药的质量。

上述补充检验方法的色谱分析时间均为40 min，不利于日常监管快速分析。同时，阿胶原药材（供试品称样量0.1 g）和阿胶补血膏及阿胶补血口服液等中成药（供试品称样量相当于阿胶原药材0.1 g）牛皮源检查分别采用浓度为0.3 μg/ml的牛皮特征肽A对照品溶液和100 μg/ml的黄明胶对照药材溶液作为牛皮源成分的对照溶液。监管中发现两种不同的对照溶液其m/z641.3（双电荷）→726.2和m/z641.3（双电荷）→783.3提取的MRM色谱峰面积值差异较大，这会导致阿胶原药材与阿胶类中成药牛皮源成分检查结果判定标准产生差异。本文旨在进一步优化补充检验方法的色谱系统，考察并比较用于制备牛皮源成分参比溶液的牛皮特征肽A对照品与黄明胶对照药材之间的差异，改进阿胶中牛皮源成分补充检验方法，为更合理有效的监管提供支持。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters Acquity 型超高效液相色谱仪-Xevo TQ-S三重四级杆质谱仪（美国Waters公司）；XS205 DU型电子天平（Mettler Toledo仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

胰蛋白酶（批号：140615-200206），牛皮特征肽A对照品（批号：111941-201804，含量93.8 %），阿胶对照药材（批号：121274-201703），黄明胶对照药材（批号：121695-201301，中国食品药品检定研究院）；乙腈（LC-MS级，赛默飞世尔）；碳酸氢铵（分析纯，国药集团）；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Waters BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1 %甲酸溶液（B），梯度洗脱：0～10 min，5 %A～11 %A；10～11 min，11 %A～80 %A；11～13 min，80 %A；13～13.01 min，80 %A～5 %A；13.01～15 min，5 %A；流速为0.3 ml/min；柱温为30 ℃；进样体积为5.0 μl。

2.2 质谱条件

采用电喷雾正离子模式，监测模式：MRM，选择牛皮特征多肽m/z641.3（双电荷）→726.2和m/z641.3（双电荷）→783.3作为检测离子对，喷雾电压3.5 kV，锥孔电压30 V，脱溶剂温度350 ℃，脱溶剂气体流量1000 L/min。

2.3 溶液的制备

2.3.1 牛皮特征肽A对照品溶液的制备 取牛皮特征肽A对照品16 mg，精密称定，置50 ml量瓶中，加1 %碳酸氢铵溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取1 ml，置100 ml量瓶中，加1 %碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀；精密量取1 ml，置10 ml量瓶中，加阿胶基质溶液（取阿胶对照药材粉末0.1 g，置50 ml量瓶中，加1 %碳酸氢铵溶液40 ml，超声处理30 min，加1 %碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，即得）稀释至刻度，摇匀（每1 ml含牛皮特征肽A 0.3 μg），取该溶液于10 000 r/min离心10 min，取上清300 μl，置1.5 ml离心管中，加胰蛋白酶溶液（1 mg/ml）30 μl，摇匀，37 ℃恒温酶解12 h，即得。

2.3.2 黄明胶对照药材溶液的制备 称取黄明胶对照药材粉末0.1 g，置50 ml量瓶中，加1 %碳酸氢铵溶液40 ml，超声处理30 min，加1 %碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取0.5 ml，置10 ml量瓶中，加阿胶基质溶液稀释至刻度，摇匀（每1 ml含黄明胶对照药材 100 μg），10 000 r/min离心10 min，取上清300 μl，置1.5 ml离心管中，加胰蛋白酶溶液（1 mg/ml）30 μl，摇匀，37 ℃恒温酶解12 h，即得。

2.3.3 阿胶对照药材溶液的制备 称取阿胶对照药材0.1 g，加1 %碳酸氢铵溶液50 ml，超声处理30 min，10 000 r/min离心10 min，取上清300 μl，置1.5 ml离心管中，加胰蛋白酶溶液（1 mg/ml）30 μl，摇匀，37 ℃恒温酶解12 h，即得。另取0.1 ml超纯水替代阿胶对照药材，同法制备空白溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性 分别取空白溶液、阿胶对照药材溶液、牛皮特征肽A对照品溶液及黄明胶对照药材溶液，以牛皮特征肽段m/z641.3（双电荷）→726.2和m/z641.3（双电荷）→783.3作为检测离子对进行测定，结果牛皮特征肽A对照品溶液及黄明胶对照药材溶液在保留时间3.5 min检出相应的色谱峰，而空白溶液和阿胶对照药材溶液的提取离子流色谱图中均无相应的色谱峰。因此空白和阿胶对照药材对牛皮源成分的检测不构成干扰，表明方法的专属性较好，详见图1 A～D。

图1 专属性试验中牛皮源成分的提取离子流色谱图

2.4.2 重复性 按2.3.1和2.3.2项下方法分别制备牛皮特征肽A对照品溶液及黄明胶对照药材溶液各6份，进样测定。结果牛皮特征肽A对照品m/z641.3（双电荷）→783.3和m/z641.3（双电荷）→726.2 MRM色谱峰面积的平均值（n=6）分别为108 839和130 251，RSD分别为1.1 %和1.5 %；黄明胶对照药材溶液MRM色谱峰面积的平均值（n=6）分别为58 234和69 905，RSD分别为2.6 %和2.1 %。结果表明重复性较好，0.3 μg/ml牛皮特征肽A对照品溶液MRM色谱峰面积的平均值约为100 μg/ml黄明胶对照药材溶液的1.9倍。

2.4.3 线性关系考察

2.4.3.1 牛皮特征肽A对照品 取牛皮特征肽A对照品16 mg，精密称定，置50 ml量瓶中，加1 %碳酸氢铵溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取1 ml，置100 ml量瓶中，加1 %碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀；精密量取0.05，0.1，0.2，0.5，1.0，2.0 ml，分别置10 ml量瓶中，加阿胶基质溶液释至刻度，摇匀，按2.3.1项下方法酶解处理并进样测定。以牛皮特征肽A对照品的浓度（C，μg/ml）为横坐标，以m/z641.3（双电荷）→726.2通道的MRM色谱峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归，结果线性方程为Y=436 508.5C-57.0，相关系数r为1.0000，表明在0.016～0.65 μg/ml的浓度范围内，线性关系良好。

2.4.3.2 黄明胶对照药材 取黄明胶对照药材约100 mg，精密称定，置50 ml量瓶中，加1 %碳酸氢铵溶液40 ml，超声40 min，放冷，加1 %碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀；精密量取0.1，0.2，0.3，0.5，1.0 ml，分别置10 ml量瓶中，加阿胶基质溶液释至刻度，摇匀，按2.3.2项下方法处理并进样测定。以黄明胶对照药材的浓度（C，μg/ml）为横坐标，以m/z641.3（双电荷）→726.2通道的MRM色谱峰积（Y）为纵坐标，进行线性回归，结果线性方程为Y=688.2C-193.6，相关系数r为0.9996，即在20.83～208.26 μg/ml的浓度范围内线性关系良好。

2.5 模拟样品的检测

称取阿胶对照药材0.1 g，精密加入黄明胶对照药材7.5 mg，按2.3.3项下方法处理，平行制备6份含牛皮源成分的供试品溶液，进样测定。结果发现6份供试品溶液中均检出m/z641.3（双电荷）→783.3和m/z641.3（双电荷）→726.2 MRM色谱峰，其峰面积的平均值（n=6）分别为86 291和102 871，RSD为3.4 %和4.6 %。

3 讨论

3.1 色谱系统的优化

阿胶中牛皮源含量补充检验方法的色谱洗脱时间为40 min，加上色谱系统的再平衡时间，整个采集时间近45 min。本研究采用柱长为50 mm、填料粒径为1.7 μm的超高效色谱柱替代原标准的柱长为100 mm、粒径为1.8 μm的色谱柱。基于替换的色谱柱其柱长更短、粒径更小，在保证方法分离效果的基础上，经不断调整梯度洗脱程序，最终将补充检验方法的梯度洗脱程序由“0～25 min，5 %A～20 %A；25～40 min，20 %A～50 %A”改为“0～10 min，5 %A～11 %A；10～11 min，11 %A～80 %A；11～13 min，80 %A；13～13.01 min，80 %A～5 %A；13.01～15 min，5 %A”，A为乙腈，B为0.1 %甲酸溶液，将总采集时间控制为15 min，有效缩短了分析时间，方法学考察结果也表明方法的专属性强、精密度、重复性较好，线性关系良好，可用于牛皮源成分的快速分析。

3.2 阿胶原药材与含阿胶中成药中牛皮源成分判定标准问题

阿胶原药材（取样0.1 g）采用0.3 μg/ml的牛皮特征肽A对照品，而阿胶补血膏和阿胶补血口服液（相当于阿胶原药材0.1g）则采用100 μg/ml的黄明胶对照药材。重复性试验发现，以m/z641.3（双电荷）→726.2提取的MRM色谱图中，牛皮特征肽A对照品溶液MRM色谱峰面积约为黄明胶对照药材溶液的1.9倍。即阿胶原药材中牛皮源成分限度要求比阿胶补血膏及阿胶补血口服液等中成药明显宽松。模拟供试品溶液中均检出牛皮源成分，其m/z641.3（双电荷）→726.2提取的MRM色谱峰面积值均低于牛皮特征肽A对照品溶液中相应的峰面积值，但却高于黄明胶对照药材制备的牛皮源成分对照溶液相应的峰面积值，依据标准，前者应判定为未检出牛皮源成分，而后者则判定为检出牛皮源成分。因此有必要将阿胶原药材与阿胶中成药中牛皮源成分的判定标准进行统一。建议将阿胶药材中牛皮特征肽A对照品的浓度降低1.9倍，亦或采用100 μg/ml的黄明胶对照药材作为牛皮源成分的对照溶液。

3.3 阿胶与其他胶类药材牛皮源成分判定标准问题

阿胶原药材（取样0.1 g）采用0.3 μg/ml的牛皮特征肽A对照品作为牛皮源成分对照溶液，而龟甲胶（标准编号：2014013）[8]和鹿角胶（标准编号：2014014）[9]等胶类原药材（取样0.1 g）中牛皮源成分补充检验方法则采用100 μg/ml的黄明胶对照药材作为牛皮源成分的对照溶液，即阿胶原药材中牛皮源成分限度比龟甲胶、鹿角胶等胶类药材更为宽松，本着合理监管的角度，建议阿胶中牛皮源成分的限度从严控制，从而与其他胶类药材的判定标准统一。

3.4 不同牛皮源成分参比品的比较

牛皮特征肽A对照品属于多肽类产品，稳定性较差，需要在-20 ℃以下冷冻保存，日常使用中运输要求较高且对照品的价格较为昂贵，而黄明胶对照药材在室温下即可稳定保存且价格较便宜。本着稳定性、易获得性和经济性的考虑，建议“阿胶中牛皮源含量的补充检验方法”修订为采用黄明胶对照药材制备牛皮源成分参比溶液。

4 结论

本文对阿胶原药材及含阿胶中成药中牛皮源成分检查补充检验方法进行了优化，将分析时间由40 min缩短至15 min，有效提高了分析速度。同时对阿胶原药材标准中采用的牛皮特征肽A对照品和阿胶补血膏及阿胶补血口服液中采用的黄明胶对照药材进行了考察，结果表明二者的m/z641.3（双电荷）→726.2 MRM色谱峰面积值相差约1.9倍。相同样品量下将会导致阿胶原药材与中成药中牛皮源成分的判定标准不统一，本着严格监管的原则，同时从对照品的稳定性和经济性上考虑，建议阿胶中牛皮源检查补充检验方法修订为采用100 μg/ml的黄明胶对照药材制备牛皮源成分的参比溶液。