RP-HPLC法测定大鼠血浆中木犀草苷的浓度*

孙赫阳 于 宁 潘德丽 田景振 李 菲

1. 山东第一医科大学(山东省医学科学院)，山东 泰安 271016；2. 山东中医药大学，山东 济南 250355

木犀草苷又名木犀草素-7-O-葡萄糖苷，是一种天然黄酮类化合物。研究发现，木犀草苷具有解热、镇痛、抗炎、止咳、祛痰等多种功效，具有抗呼吸道合胞病毒、流感A型病毒等多种病毒活性[1-2]。同时，对损伤的心肌细胞具有较强的保护作用，并可抑制多种肿瘤细胞增殖，起到抗肿瘤作用[3-4]。部分菊科、忍冬科、豆科等植物中都含有木犀草苷，2015年版《中国药典》要求将木犀草苷作为金银花、菊花、锦灯笼控制药材质量的指标。因此，木犀草苷作为上述药材的质量控制指标，是含有金银花、菊花等中成药的主要活性成分，也是此类中成药进行质量控制和考察制剂药动学特征的主要指标成分[5-7]。本研究建立了HPLC法测定大鼠血浆中木犀草苷的浓度，便于含有木犀草苷的制剂进行药动学及生物利用度的研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1仪器 依利特P230Ⅱ高效液相色谱仪(包括UV230Ⅱ紫外-可见检测器，EC2006色谱数据处理工作站，大连依利特分析仪器有限公司)；TDL-40B离心机(上海安亭科学仪器厂)；XW-80A涡旋混合仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；3K30超速冷冻离心机(德国Sigma公司)；UPT-I-107超纯水机(成都超纯科技有限公司)；BT-25S电子天平(塞多利斯科学仪器北京有限公司)。

1.1.2试剂 芦丁对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号：Y22S6S3719)；木犀草苷对照品(上海纯优生物科技有限公司，批号17030705)；乙腈、甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

1.1.3实验动物 健康Wistar大鼠，雌雄各半，体重180～220 g，由山东鲁抗医药有限公司提供，合格证号：SCXK(鲁)20130001。

1.2 方法及统计学分析

1.2.1溶液的配制 对照品溶液：精密称取木犀草苷对照品4.8 mg，加甲醇溶解、定容至50 ml，得到质量浓度为96.0 μg·ml-1对照品储备液。储备液加甲醇逐级稀释，分别得到48、24、12、6、3 μg·ml-1系列浓度的溶液。

内标溶液：精密称取芦丁对照品5.0 mg，加甲醇溶解、定容至50 ml，得到浓度为100 μg·ml-1对照品储备液。

1.2.2检测波长的选择 分别取芦丁对照品和木犀草苷对照品适量，加甲醇溶解，以甲醇为空白对照，分别在UV波长200～400 nm范围内进行扫描。

1.2.3色谱条件 色谱柱：大连依利特C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，并配以C18预柱(10 mm × 4.6 mm)；流动相：乙腈-0.2﹪磷酸(20∶80)；内标：芦丁；检测波长：348 nm；流速：1.0 ml·min-1；柱温：室温；进样量：20 μl。

1.2.4血浆样品的处理 取血浆样品200 μl，加入内标芦丁溶液20 μl，涡旋30 s。分别加入甲醇、乙腈各200 μl，涡旋30 s，4 ℃、15000 r·min-1离心15min。取上清，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液按“1.2.3”项下色谱条件进行HPLC测定。

1.2.5线性范围和定量下限 取大鼠空白血浆160 μl，加入不同浓度的木犀草苷对照品溶液40μl，使得血浆中木犀草苷浓度分别为0.60、1.20、2.40、4.80、9.60、19.20 μg·ml-1。按照“1.2.4”项处理血浆，进样测定，以木犀草苷与芦丁的峰面积比值(Ai/A，Y)对木犀草苷质量浓度(X)进行线性回归。

1.2.6回收率 取大鼠空白血浆160 μl，加入不同浓度木犀草苷对照品溶液40 μl，使血浆中木犀草苷浓度分别为4.8、9.6、19.2 μg·ml-1，每个浓度5个样品。按照“1.2.4”项下方法处理后进样测定，依照标准曲线的回归方程计算样品中所含木犀草苷量，计算方法回收率。

1.2.7精密度 取大鼠空白血浆160 μl，加入木犀草苷对照品溶液，制成血浆中木犀草苷浓度分别为4.8、9.6、19.2 μg·ml-1的样品，按照“1.2.4”项下方法处理，分别于1d内连续测定5次及5 d内每天测定1次，计算日内精密度以及5 d内的日间精密度。

1.2.8稳定性 取大鼠空白血浆160 μl，加入木犀草苷对照品溶液，使木犀草苷在血浆中浓度分别为4.8、9.6、19.2 μg·ml-1，每个浓度样品各5个，在以下不同条件下处理：室温放置8 h、-20 ℃冻存1周和-20 ℃冷冻-室温解冻3次，按照“1.2.4”项下方法处理后进样测定，测得值与0 h测得值比较计算回收率。

2 结 果

2.1 检测波长的选择

芦丁对照品和木犀草苷对照品溶液UV波长200～400 nm范围内扫描结果见图1。

图1 芦丁(A)和木犀草苷(B)对照品紫外扫描图谱

由图1可见，芦丁和木犀草苷均在348 nm波长处有较大吸收峰，故检测波长确定为348 nm。

2.2 方法的专属性

大鼠空白血浆、空白血浆加入内标溶液、空白血浆加入内标和木犀草苷对照品溶液、样品血浆加入内标溶液的色谱图见图2。

图2 大鼠空白血浆(A)、大鼠空白血浆+内标(B)、空白血浆+内标+木犀草苷(C)、血浆样品+内标(D)HPLC色谱图 1-内标；2-木犀草苷

从图2可知，内标芦丁和木犀草苷的保留时间分别为8.0、10.1 min，且主峰、内标峰及相邻物质峰间可完全分离，内源性成分对测定无干扰。

2.3 线性范围和定量下限

以木犀草苷与芦丁的峰面积比值(Ai/A，Y)对木犀草苷质量浓度(X)进行线性回归，得回归方程Y=0.0865X+0.0232，r=0.9980。结果表明，木犀草苷在0.60～ 19.20 μg·ml-1范围内线性关系良好，定量下限为0.60 μg·ml-1。

2.4 回收率

低、中、高三个浓度的血浆样品中木犀草苷的方法回收率结果见表1。

表1 木犀草苷在大鼠血浆中的方法回收率

2.5 精密度

日内精密度以及日间精密度结果见表2。

表2 木犀草苷在大鼠血浆中的精密度

结果表明，低、中、高三个浓度的血浆样品中木犀草苷的回收率在90.53%～94.97%，RSD均小于6%，说明该法的方法回收率符合样品测定要求。

由表2可见，样品日内和日间的精密度良好。

2.6 稳定性

木犀草苷在大鼠血浆中的稳定性结果见表3。

表3 木犀草苷在大鼠血浆中的稳定性

由表3可见，木犀草苷血浆样品在不同处理条件下均稳定，符合样品测定要求。

3 讨 论

结合相关文献[8-9]报道，实验中分别考察了金丝桃苷、黄芩苷、刺五加苷B、槲皮素作为内标的情况。结果表明，在流动相为乙腈-0.2%甲酸(20∶80)时，金丝桃苷的保留时间为9.6 min，与木犀草苷峰无法完全分离；黄芩苷、刺五加苷B和槲皮素的保留时间均大于20 min，与木犀草苷保留时间相差过多。芦丁与木犀草苷的保留时间接近，且二者的色谱峰完全分离，利于提高检测的准确度和效率。同时，二者在348 nm均有较强吸收，可以采用同一波长进行测定，避免了切换波长可能导致基线波动的情况出现。血浆样品处理采用的是蛋白沉淀法，固定有机溶剂和血浆的体积比为2∶1，单用甲醇沉淀蛋白木犀草苷的提取率为56.95%，采用甲醇和乙腈(1∶1)处理血浆木犀草苷提取率达到85.0%以上。因此，选择甲醇和乙腈(1∶1)为溶剂采用蛋白沉淀法处理样品。该法药物的回收率高，重现性好，且操作简便、快速，可用于测定血浆中木犀草苷的浓度。