HPLC-MS/MS测定小儿消食片中槟榔碱的含量

刘爱明，徐玲玲，王迎春，王 芳，逯海燕，刘小雨，戚 敏，陈 凯

（山东省药学科学院，山东 济南 250101）

小儿消食片收载于《中华人民共和国药典》2020年版一部，由炒鸡内金、山楂、六神曲（炒）、炒麦芽、槟榔、陈皮六味中药经多步工艺制成。功能主治为消食化滞，健脾和胃。用于食滞肠胃所致积滞，症见食少、便秘、脘腹胀满、面黄肌瘦[1]。该药入口酸甜可口，具有使小儿易于接受的优点[2]，临床用于治疗小儿消化类疾病，是家庭常备药品[3-4]。槟榔碱的药理活性主要为刺激交感神经，通过细胞外Ca2+内流介导M胆碱受体兴奋，使胃肠平滑肌张力升高[5-6]，增强肠蠕动，增加消化液分泌，使食欲增加，起到消食作用[7]。但过量的槟榔碱可引起毒性[8-10]。目前槟榔碱的含量测定方法主要有酸碱滴定法[1]、薄层扫描法、毛细管电泳法[11]、高效液相色谱（HPLC）法[12-13]等。由于小儿消食片成分复杂，酸碱滴定法只能测定总生物碱的含量；薄层扫描法、毛细管电泳法操作繁复、准确度低；HPLC法准确度高，但样品前处理步骤繁琐，耗时长，方法灵敏度较低。因此这些方法都存在一定的局限性。

为了克服现有技术存在的缺陷和不足，本文提供了一种重现性好、灵敏度高、分析速度快、样品前处理简单的小儿消食片中槟榔碱含量的检测方法，可用于槟榔碱的含量测定与小儿消食片的质量控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260-6430液相色谱-质谱联用系统（LC-MS/MS，美国安捷伦），包括G1379B型脱气机，G1312B型二元输液泵，G1367E型自动进样器，G1330B型控温模块，G1316A型柱温箱，6430 MS/MS系统及Mass hunter数据采集软件；FE20型pH计[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；AUW-120D型电子分析天平（日本岛津）；ME-204E型电子分析天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；Milli-Q超纯水机[默克化工技术（上海）有限公司]；KQ3200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；LED加热磁力搅拌器（美国巴罗克）。

1.2 试药

小儿消食片（每片重0.3 g，由生产单位提供）；氢溴酸槟榔碱（批号：111684-200401，中国食品药品检定研究院）；地西泮（批号：171225-201304，中国食品药品检定研究院）；甲醇（色谱纯，Merck）；乙酸铵（质谱级，Fisher scientific）；甲酸（质谱级，Fisher scientific）；0.9 %氯化钠注射液，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 HPLC-MS/MS条件

色谱条件：采用Agilent 1260高效液相仪，色谱柱为Agilent Poroshell 120 SB-C18柱（4.6 mm×75 mm，2.7 μm）；流动相为10 mmol/L乙酸铵溶液（用甲酸调pH至5.2）（A）与甲醇（B），洗脱梯度：0～0.5 min，15 %B；0.5～2.1 min，15 %B→90 %B；2.1～3.0 min，90 % B；3.1～6 min，15 %B。样品检测时间：6 min；流速：1.0 ml/min；进样量：5 μl；柱温：40 ℃。

质谱条件：采用Agilent 6430三重四极杆质谱仪，电喷雾正离子源，多反应监测（MRM）分析模式。干燥气：N2；干燥气流速：10 L/min，干燥气压力：45 psi，干燥气温度：350 ℃，毛细管电压：4000 V。定量离子对：槟榔碱：[M+H]+m/z156.1/44.2，碎片电压：100 V，碰撞能量：13 eV；内标地西泮：[M+H]+m/z285.1/193.1，碎片电压：150 V，碰撞能量：30 eV。

2.2 溶液的制备

2.2.1 内标储备溶液的制备 精密称取地西泮10 mg，置100 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取1 ml，置入10 ml量瓶，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得10 μg/ml内标储备液。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取氢溴酸槟榔碱对照品15 mg，置入100 ml量瓶，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取1 ml，置入10 ml量瓶，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得槟榔碱含量约为10 μg/ml的对照品储备液。取0.5，2，5，10，20 ml对照品储备液，加入2.2.1项下内标储备液1 ml，用甲醇稀释，分别配制不同浓度的对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取本品若干片，研细后取约0.6 g，精密称定，置入25 ml量瓶，加水定容至刻度，置磁力搅拌器上，850 r/min搅拌5 min，即得浓度为24 mg/ml的供试品混悬液。精密移取供试品混悬液3 ml，置入EP管，超声30 min，0.22 μm微孔滤膜过滤。分别精密量取续滤液500 μl、甲醇490 μl及2.2.1项下内标储备液10 μl，置入EP管，混匀，作为供试品溶液。

2.2.4 阴性对照溶液的制备 取处方中除槟榔外的中药材适量，按处方比例及制备工艺同法制片，并按2.2.3项下方法制备阴性对照溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 取2.2.4项下阴性对照溶液，按2.1项条件进样检测，得阴性对照溶液图谱（见图1）；取2.2.2项下对照品储备液200 μl、甲醇790 μl及2.2.1项下内标储备液10 μl，置入EP管，混匀，按2.1项条件进样检测，得对照品溶液（含内标）图谱（见图2）；取2.2.3项下供试品溶液按2.1项条件进样检测，得供试品溶液图谱（见图3）。结果表明，供试品与对照品出峰位置一致，内标和阴性对照均不干扰待测物的准确定量。

图1 阴性对照溶液图谱

图2 对照品溶液（含内标）图谱

图3 供试品溶液图谱

2.4 线性关系的考察

取2.2.2项下对照品储备液0.5，2，5，10，20 ml，分别置入100 ml量瓶，加入2.2.1项下内标储备液1 ml，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得浓度分别为50，200，500，1000，2000 ng/ml的对照品溶液。按2.1项下HPLC-MS/MS条件测定，以槟榔碱的浓度（按氢溴酸槟榔碱浓度/1.5214计）为横坐标X，槟榔碱与内标物的峰面积比值为纵坐标Y，用加权最小二乘法（权重为1/X2）进行回归运算，求得的直线方程即为标准曲线。回归方程为Y=0.173930X+0.001489，r=0.9979（n=5）。结果表明，槟榔碱在50～2000 ng/ml范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验

取2.2.2项下对照品储备液200 μl、甲醇790 μl及2.2.1项下内标储备液10 μl，置入EP管，混匀，得对照品溶液（含内标）。按2.1项下HPLC-MS/MS条件测定，连续进样6次，计算色谱图中槟榔碱和内标峰面积比值的RSD为1.6 %，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

取批号为1601016的样品6份，分别按2.2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项下HPLC-MS/MS条件测定，计算6份样品中槟榔碱含量的RSD为1.2 %，表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

取2.2.3项下同一供试品溶液，室温下放置4 h，分别在0，2，4 h时取样，按2.1项下HPLC-MS/MS条件测定，记录峰面积，计算色谱图中槟榔碱和内标峰面积比值的RSD为1.3 %，表明供试品溶液在4 h内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的同一批（批号：1601016）供试品，研细后精密称定，每份约0.6 g，3份为一组，分别加入一定量的2.2.2项下对照品贮备液，3组样品中槟榔碱的含量与加入槟榔碱的含量比值分别为1:1.5，1:1，1:0.5，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项HPLC-MS/MS条件检测，测得槟榔碱的平均加样回收率为100.91 %，RSD为1.30 %（n=9），说明该方法准确度良好，见表1。

表1 加样回收率测定结果（n=9）

2.9 含量测定

取3个不同批次的小儿消食片，分别按2.2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项下HPLC-MS/MS条件测定槟榔碱含量，结果见表2。

表2 供试品含量测定结果

3 讨论

通过查阅文献[11-13]，选择先用水制备供试品混悬液，再用甲醇提取，提取方式选择超声30 min。分别考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-甲酸溶液等不同流动相系统的分离效果，最终确定色谱条件：流动相A：10 mmol/l乙酸铵溶液（用甲酸调pH至5.2）；流动相B：甲醇。洗脱方式：梯度洗脱；洗脱梯度程序如下：0～0.5 min，15 %B；0.5～2.1 min，15 %B→90 %B；2.1～3.0 min，90 %B；3.1～6 min，15 %B。该方法操作简单，操作时间短，专属性强、灵敏度高、稳定、可靠，可用于槟榔碱的含量测定及小儿消食片质量控制。