注射用清开灵（冻干）调配方法优化及其在不同溶媒中稳定性的研究

蔡杨靖，潘 云

（海南医学院第二附属医院，海南 海口 570100）

注射用清开灵（冻干）由栀子、黄芩苷、金银花、板蓝根、胆酸、猪去氧胆酸、珍珠母、水牛角组成，具有清热解毒，化痰通络，醒神开窍的功效，主要用于上呼吸道感染，高热。临用前用注射用水溶解，用于肌内注射及重症静脉滴注。静脉滴注用氯化钠注射液或10 %葡萄糖注射液稀释，临床使用中，不局限于这两种溶媒。中药注射剂与不同溶媒配伍后，成品输液中含量、pH值及不溶性微粒数会出现不同变化。成品输液从配制到用药，保证其稳定性可获得最佳药效，同时减少不良反应。本研究采用正交试验优化注射用清开灵（冻干）的调配技术，使其溶解达到最佳效果，采用高效液相色谱法（HPLC）测定配伍后成品输液的栀子苷、黄芩苷、绿原酸的含量变化，并测定成品输液的pH值、不溶性微粒数，考察注射用清开灵（冻干）与不同溶媒配伍的稳定性，为该药的临床合理使用提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695高效液相色谱仪（美国Waters公司）；KQ-500DA型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；PHS-3C型pH计（上海雷磁仪器厂）；GWF-5JS 型微粒分析仪（天河医疗仪器有限公司）；AB-135S型电子天平（d=0.01 mg，瑞士梅特勒公司）； KJ-202 型振荡器（江苏康健医疗用品有限公司）。

1.2 试药

栀子苷对照品（批号：110749-201919，纯度：97.1 %），黄芩苷对照品（批号：110715-201821，纯度：95.4 %），绿原酸对照品（批号：110753-201817，纯度：96.8 %，中国食品药品检定研究院）；注射用清开灵（冻干）（贵州益佰制药有限公司，规格：200 mg/支，批号：20190814）；0.9 % 氯化钠注射液（湖南科伦药业股份有限公司，规格：250 ml，批号：A19072203-1）；5 %葡萄糖注射液（湖南科伦药业股份有限公司，规格：250 ml，批号：A19081506-2）；10 %葡萄糖注射液（湖南科伦药业股份有限公司，规格：250 ml，批号：A19101102-1）；葡萄糖氯化钠注射液（湖南科伦药业股份有限公司，规格：250 ml，批号：A19061305-2）；乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 正交试验

以灭菌注射用水为溶媒，溶媒体积（A）、振荡频率（B）、振荡时间（C）为因素，设计三因素二水平正交试验，以不溶性微粒数为指标，选取最佳调配方法，因素水平见表1。分别取本品1支按正交试验设计进行试验，结果见表2～4。

表1 正交试验因素水平表

表2 正交试验设计与结果

由表3可见，≥10 μm及≥25 μm微粒数极差结果均显示各因素对不溶性微粒数影响大小为：A＞B＞C，≥10 μm及≥25 μm微粒数的均值均显示最佳调配方式为A1B2C1。表4方差分析结果显示，溶媒体积对≥10 μm及≥25 μm微粒数有显著影响（P<0.05），振荡频率对≥10 μm微粒数有一定影响（P<0.1），振荡时间对≥10 μm及≥25 μm的微粒数无明显影响。综上，最终确定最佳溶解方式为A1B2C1即每支注射用清开灵（冻干）加5 ml灭菌注射用水，1000 r/min振荡3 min。

表3 正交试验结果分析

表4 正交试验结果方差分析

2.2 主成分含量测定方法

2.2.1 色谱条件 色谱柱：XBridge C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相[1-5]：乙腈（A）-0.3 %磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～7 min，10 %A；7～12 min，20 %A；12～20 min，25 %A）；流速：1.0 ml/min；检测波长[6]：0～7 min，327 nm；7～12 min，238 nm；12～20 min，280 nm。柱温：30 ℃；进样量：10 μl。

2.2.2 溶液的制备 对照品溶液的制备：精密称取栀子苷、绿原酸、黄芩苷对照品适量，加50 %甲醇制成每1 ml中含栀子苷0.832 μg、绿原酸0.224 μg、黄芩苷7.448 μg的混合对照品溶液。

成品输液的制备：取注射用清开灵12支，每支注入5 ml灭菌注射用水，于振荡器中1000 r/min振荡3 min，静置后分别加至0.9 %氯化钠注射液、5 %葡萄糖注射液、10 %葡萄糖注射液、葡萄糖氯化钠注射液250 ml中，每种溶媒平行制备3份。

供试品溶液的制备：精密吸取上述成品输液2 ml，置50 ml量瓶中，加50 %甲醇稀释至刻度，过滤，即得。

空白溶液的制备：分别精密吸取0.9 %氯化钠注射液、5 %葡萄糖注射液、10 %葡萄糖注射液、葡萄糖氯化钠注射液2 ml，分别置50 ml量瓶中，加50 %甲醇稀释至刻度，过滤，即得。

2.2.3 专属性考察 分别取上述对照品溶液、供试品溶液和空白溶液，按2.2.1项下色谱条件进样测定。结果见图1。

图1 专属性考察HPLC图谱

2.2.4 线性关系考察 取上述对照品溶液1.0，2.0，5.0，8.0，10 ml，分别置10 ml量瓶中，用50 %甲醇稀释至刻度。按2.2.1项下色谱条件进样分析，记录色谱图。以峰面积为纵坐标（Y），对照品浓度为横坐标（X）进行线性回归。结果见表5。

表5 3种成分的回归方程及线性范围

2.2.5 精密度试验 取2.2.2项下配制的混合对照品溶液10 μl，按2.2.1项下色谱条件，连续进样6次，记录色谱图。栀子苷、绿原酸、黄芩苷峰面积RSD分别为0.73 %，0.83 %，0.31 %，表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 取2.2.2项下配制的供试品溶液，分别于0，4，6，10，15，20，24 h进样。栀子苷、绿原酸、黄芩苷峰面积RSD分别为0.78 %，0.93 %，0.54 %，表明供试品溶液中栀子苷、绿原酸、黄芩苷含量放置24 h稳定。

2.2.7 重复性考察 取供试品6份，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件进样测定。结果，栀子苷、绿原酸、黄芩苷含量RSD分别为0.64 %，0.76 %，0.45 %，表明该方法重复性良好。2.2.8 加样回收试验 精密量取4种溶媒配制的成品输液各9份，每份1 ml，置50 ml容量瓶中，分别精密加入80 %，100 %，120 % 3种浓度水平的混合对照品溶液1 ml。按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件下进样分析，测定绿原酸、栀子苷、黄芩苷的含量，计算加样回收率。结果，回收率在98.9 %～101.8 % 之间。计算过程以0.9 %氯化钠注射液配制的成品输液为例，见表6。

表6 加样回收率试验结果

2.3 成品输液稳定性测定

2.3.1 含量变化 按2.2.2项下方法配制成品输液，分别于 0，1，2，4，6，8 h测定成品输液中栀子苷、绿原酸、黄芩苷的含量。结果显示，8 h内各成品输液中栀子苷、绿原酸、黄芩苷的含量变化幅度均未超过10 %，满足输液配伍要求[7]，见表7。

表7 注射用清开灵（冻干）在不同溶媒中主要成分的相对含量变化情况（n=3)

2.3.2 成品输液pH值变化 测定0，1，2，4，6，8 h时成品输液pH值，结果各成品输液pH值在8 h内均呈逐渐减小趋势，见表8。

表8 注射用清开灵（冻干）在不同溶媒中pH值随时间的变化（n=3）

2.3.3 成品输液不溶性微粒变化 2020年版《中华人民共和国药典》规定[8]，标示装量为100 ml或100 ml以上的静脉用注射液，除另有规定外，每1 ml中含10 μm及10 μm以上的微粒数不得超过25粒，含25 μm及25 μm以上的微粒数不得超过3粒。本试验于0，1，2，4，6，8 h时测定成品输液不溶性微粒数。结果，成品输液不溶性微粒数8 h均呈增多的趋势，其中0.9 %氯化钠输液8 h时含25 μm及25 μm以上的微粒数超出药典要求，5 %葡萄糖输液6 h时含10 μm及10 μm以上的微粒数及含25 μm及25 μm以上的微粒数均超出药典要求，10 %葡萄糖输液8 h时含10 μm及10 μm以上的微粒数超出药典要求，葡萄糖氯化钠输液6 h时含25 μm及25 μm以上的微粒数超出药典要求，结果见表9。

表9 注射用清开灵在不同溶媒中微粒数随时间的变化（n=3）

3 讨论

3.1 正交试验考察

中药注射剂成分复杂，不溶性微粒数超标有较大的安全隐患，可能引起炎症、肉芽肿、热原反应等，以及血管物理方面的改变、血浆生化水平的改变等[9]。调配及与不同溶媒配伍过程中均会产生不溶性微粒增多现象，因此在考察注射用清开灵与不同溶媒配伍稳定性试验前，应选取最佳调配方法。本试验采用正交试验法选取最佳调配方法。注射用清开灵说明书中规定，临用前每支用5 ml注射用水溶解，故选择注射用水为溶媒，选择溶媒体积、振荡频率、振荡时间为因素进行试验。结果，最佳调配方式为每支注射用清开灵（冻干）加5 ml灭菌注射用水，以1000 r/min频率振荡3 min溶解。

3.2 不同溶媒中稳定性考察

溶媒的合理选择是保障中药注射剂稳定性的前提，与不同溶媒配伍，pH值、澄明度、不溶性微粒、颜色会出现不同的变化，不当的配伍会导致不良事件的发生[10]。另药品从调配到患用药会产生一定时间，时间过长药效降低[11]，一般对于药物稳定性的研究限于 6 h 或 8 h 内[12]。故本试验选择了临床上常见的4种溶媒，考察注射用清开灵与不同溶媒配伍后8 h内的含量、不溶性微粒数、pH值的变化。结果，8 h内各成品输液中3种主成分含量随时间的增加均出现下降的变化趋势，这可能是由于配伍后pH值发生变化导致药物的溶解度出现变化。各成品输液的pH值8 h内均逐渐降低，6 h时0.9 %氯化钠输液、10 %葡萄糖输液pH值小于6.0，4 h时葡萄糖氯化钠输液、5 %葡萄糖输液pH值小于6.0，易产生沉淀，不宜使用[13]。不溶性微粒方面，各成品输液不溶性微粒数8 h内均呈增多趋势，6 h时5 %葡萄糖输液、葡萄糖氯化钠输液不溶性微粒超出药典要求，8 h时4种成品输液不溶性微粒均超出药典要求。

因此，临床使用中，注射用清开灵（冻干）采用最佳调配方法溶解后，宜使用0.9 %氯化钠或10 %葡萄糖注射液为溶媒，现用现配。若采用5 %葡萄糖注射液、葡萄糖氯化钠注射液为溶媒，需在2 h内使用。