全因子试验设计优化他克莫司纳米混悬滴眼液的制备工艺

李大伟，薛 松，陈倩倩，祝美华，毛楷凡，刘正平＊

（1. 山东省药学科学院，山东 济南 250101；2. 山东福瑞达医药集团有限公司 山东省黏膜与皮肤给药技术重点实验室，山东 济南 250101）

他克莫司（tacrolimus）是一种大环内酯类新型免疫抑制剂，从筑波链霉菌中分离得到[1]，是与环孢霉素类似但更为强效的免疫抑制剂，其抑制T细胞的作用是环孢素A的10～100倍[2]。近年，他克莫司在眼部疾病中的应用受到越来越多的重视，临床上已广泛应用于春季角结膜炎[3-5]、难治性过敏性结膜炎[6-7]、自身免疫性结膜炎[8-9]、角膜移植术后免疫排斥反应[10-12]等，取得了较好的治疗效果。

他克莫司溶解性差，几乎不溶于水，因此生物利用度低，严重影响药效。纳米混悬液是以表面活性剂为稳定剂，将药物颗粒分散在水中，通过自组装技术或破碎技术制备的一种亚微胶体分散系统，粒径一般在10～1000 nm[13]。与传统意义上的基质骨架型纳米体系相比，纳米混悬液不需要载体材料，通过表面活性剂的稳定作用，将纳米级药物粒子分散在水中形成稳定的体系。纳米混悬液有以下优势：粒径小、比表面积大，与生物膜有较强的黏附、渗透作用，不易被清除，能提高生物利用度[14-15]。

本研究首先采用溶剂-反溶剂法制备他克莫司纳米微粒混悬液，然后通过离心沉淀法去除有机溶剂，加入稳定剂、pH调节剂、防腐剂、渗透压调节剂等制成中值粒径（D50）＜0.3 μm，沉降体积比＞0.9，可保持贮存稳定性的纳米混悬滴眼液，确定并优化了粒度适宜、稳定性良好的无菌他克莫司纳米混悬液的制备工艺。

在进行个税递延保险额度调整的过程中，该额度不应该是一成不变的，应该随着社会经济发展情况、物价、城市经济发展情况等因素来针对性的进行调整，同时政策调整过程中也应该与保险机构、行业协会进行充分沟通，必要时通过社会调研来了解个税递延保险发展的实际需求，使定额的调整更加科学，提升客户满意度的同时也不会破坏社会的稳定发展。

1 仪器与试药

1.1 仪器

RW 20 digital搅拌器（美国IKA公司）；Sorvall BIOS A离心机（美国赛默飞公司）；Mastersizer 2000激光粒度仪（英国马尔文仪器有限公司）。

式中，可见频率步进雷达脉冲组回波信号混频、采样后可视为一组离散Chirp信号。因此，目标高分辨距离像的运动补偿问题可以转化为Chirp信号参数估计问题。对式(10)结果进行MDCFT处理，得

1.2 试药

综合类实验室兼具上述两种或两种以上功能，如药剂学(化学与工学)、生药学(生物学与化学)、生物医学工程(生物学与放射性)等，需依据具体情况寻找和制定防控点。

他克莫司（福建科瑞药业有限公司，批号：170615，含量：99.8 %）；聚乙烯醇（江西阿尔法高科药业有限公司，批号：160922，含量：99.5 %）；苯扎氯铵[泰柯棕化（张家港）有限公司，批号：20170127，含量99.5 %]；氯化钠（河北华晨药业有限公司，批号：160619，含量：99.9 %）；磷酸二氢钠（AR；国药集团化学试剂有限公司，批号：20170218，含量：99.0 %）；磷酸氢二钠（AR，国药集团化学试剂有限公司，批号：20170218，含量：99.0 %）；无水乙醇（AR，国药集团化学试剂有限公司，批号：20170218，含量：99.7 %）。

2 方法与结果

2.1 他克莫司纳米混悬滴眼液的制备

2.1.1 他克莫司纳米微粒的制备 将他克莫司1.00 g溶解于4 ml无水乙醇中，加10 %（w/v）苯扎氯铵水溶液4 ml，搅拌均匀；经0.22 μm聚偏氟乙烯（PVDF）滤膜过滤，制得他克莫司溶液；在无菌条件下，将他克莫司溶液在高速搅拌（1500 r/min）下加入灭菌注射用水160 ml中，析出他克莫司纳米微粒，继续搅拌6 h，在无菌条件下，将上述溶液离心（10 000 r/min）10 min，收集固体，加入160 ml 注射用水，使固体微粒悬浮，再次离心（10 000 r/min）10 min，收集固体，制得他克莫司纳米微粒。

2.2.2 试验数据采集及分析 由Minitab 18版软件生成三中心全因子试验表，按设计进行试验。采用马尔文2000粒度仪测定粒径，分散相选择水，分散相折射率选择1.330，粒子折射率选择1.620，泵速设置为2000 r/min。测定结果见表2。

2.2.1 全因子试验设计 按L19（24）全因子设计表进行试验设计，考察药物-溶剂比、溶剂-反溶剂比、搅拌速度、搅拌时间对他克莫司纳米混悬液粒径的影响。

通过软件分析了主效应和二阶交互效应对粒径的影响，通过Pareto图可见搅拌速度和药物-溶剂比这2个因素显著影响他克莫司纳米微粒的粒径，见图1。对影响粒径的因素进行方差分析也可看出搅拌速度和药物-溶剂比可显著影响粒径，其P值均小于0.05。

2.2 他克莫司纳米微粒制备工艺优化

他克莫司纳米微粒制备工艺是制备他克莫司纳米混悬滴眼液的关键工艺，将影响混悬滴眼液粒度，进而影响其吸收速率和程度。研究中先后采用球磨法、高压均质法、气流粉碎法和溶剂-反溶剂法等制备纳米微粒，考察其粒径，最终选择采用溶剂-反溶剂法制备他克莫司纳米微粒。在此基础上，采用全因子试验设计进一步对他克莫司纳米微粒制备工艺进行优化研究。

2.1.3 他克莫司纳米混悬滴眼液的制备 在无菌条件下，将他克莫司纳米微粒加入辅料溶液中，搅拌均匀，加注射用水至1000 ml，即得他克莫司纳米混悬滴眼液。

表1 他克莫司纳米混悬液制备工艺全因子试验设计

2.1.2 辅料溶液的制备 将透明质酸1.20 g在搅拌下加入900 ml注射用水中，搅拌2 h以上使溶胀完全；在搅拌下加入聚乙烯醇7.00 g，继续搅拌至完全溶解；加入10 %苯扎氯铵溶液1.00 g，搅拌均匀；加入氯化钠8.50 g、磷酸氢二钠0.05 g、磷酸二氢钠0.76 g，继续搅拌溶解，加磷酸和5 mol/L氢氧化钠溶液适量调节pH值至5.0，经0.45 μm聚醚砜滤膜过滤后，121 ℃灭菌15 min即得。

表2 他克莫司纳米混悬液全因子试验设计及结果

由结果分析可知，搅拌速度和药物-溶剂比是显著影响他克莫司混悬液粒径的主要因素，为了研究搅拌速度和药物-溶剂比对粒径的影响情况，绘制了D50和D90的等值线图，其中在等值线图里控制了溶剂-反溶剂比例为1:40，搅拌时间为6 h。由图2可见快速搅拌、较小的药物-溶剂比制备的他克莫司纳米混悬液样品的粒径更小。

表3 D50方差分析表

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：①符合手术适应证；②于本院行麦默通微创旋切术；③患者及其家属自愿配合心理干预行为。排除标准：①合并精神障碍或有精神疾病史者；②近期发生重大生活事件者。③合并其他重大疾病者。

图1 对D50和D90有影响的主效应和二阶交互效应的分析

使用Minitab软件对影响他克莫司纳米混悬液粒径的因素进行分析并建模拟合。对D50进行分析拟合的结果显示其失拟P=0.37>0.05、弯曲P=0.12>0.05，对D90进行分析拟合时具有相同的规律，表明此模型合适。表3为对D50分析和拟合的结果。

图2 D50与D90的等值线图

根据以上试验结果，确定他克莫司纳米混悬液的最优工艺参数：药物-溶剂比为1:4、溶剂-反溶剂比为1:40、搅拌速度为1500 r/min、搅拌时间为6 h。

2.3 优选工艺验证

根据优化后的工艺制备3批他克莫司纳米混悬滴眼液，D50为0.18～0.21 μm，沉降体积比为0.96。将样品置温度40 ℃±2 ℃、相对湿度75 %±5 %的条件下放置6个月，分别测定0 d和1，2，3，6月时样品的D50、D90和沉降体积比，结果见表4。3批样品的D50、D90和沉降体积比结果均在限度要求范围内，6个月与0 d相比均未发生显著变化，表明采用溶剂-反溶剂法制备他克莫司纳米混悬滴眼液的工艺稳定，重复性好。

这次事件，让我明白了很多。班主任作为班级管理的第一责任人，要敢于承认自己的错误，和学生站在一条线上，用自己真诚的行为打动学生。这种榜样的力量会有更强的感染力，无形中会让学生对你敞开心扉，把班级当成自己的家，从而有利于班级的管理和良好班风的形成。

表4 优选工艺验证结果

3 讨论

本研究采用溶剂-反溶剂法制备他克莫司纳米混悬液，通过离心法去除有机溶剂制得纳米微粒，加入稳定剂、pH调节剂、防腐剂、渗透压调节剂等制成粒度D50小于0.3 μm，并具有较好稳定性的他克莫司纳米混悬滴眼液。

本研究通过全因子试验设计，研究了药物-溶剂比、溶剂-反溶剂比、搅拌速度、搅拌时间对制备纳米微粒的粒径影响，确定最优工艺参数：药物-溶剂比为1:4、溶剂-反溶剂比为1:40、搅拌速度为1500 r/min、搅拌时间为6 h。制备的3批他克莫司纳米混悬滴眼液D50均在300 nm内，沉降体积比均＞0.90；样品进行加速试验考察，6个月样品的粒径和沉降体积比与0 d样品比较，未见显著变化。实验结果表明：优选的他克莫司纳米混悬滴眼液制备工艺可行，产品质量可控，稳定性良好。