桑辛素大鼠体内代谢产物鉴定

邓志鹏，柳 佳，熊 山，韩利文

（山东第一医科大学，山东省医学科学院 药物研究所，山东 济南 250062）

桑辛素（morusin，5, 2’, 4’-三羟基黄酮），又称桑黄素，存在于桑科植物桑（Morus albaL.）的干燥根皮、树枝及桑葚中[1-2]。现代药理研究证明，桑辛素具有抗肿瘤[3-6]、抗菌[7]、抗炎[8]等药理活性。桑辛素属异戊烯基黄酮类化合物，化学结构见图1。体内外药理实验证明，黄酮类化合物具有较为显著的药效，但因该类化合物在体内可发生广泛的I相和II相代谢反应，导致其生物利用度较低[9-10]。因此，研宄该类化合物在体内的吸收及代谢过程对其药物开发有重要影响。目前桑辛素的体内代谢过程研究较少，亟需进一步研究。

图1 桑辛素的化学结构

1 材料与仪器

1.1 仪器

Thermo Scientific超高压液相串接Q-Exactive Plus Orbitrap高分辨质谱仪（美国Thermo Fisher）；EL204电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Sorvall Biofuge Stratos高速冷冻离心机（中国赛默飞世尔）；IKA Vortex天才3旋涡混匀器（广州艾卡）；氮吹仪（青岛聚创环保）。

1.2 药品与试剂

桑辛素对照品（批号：HM05275198，经HPLC 测定其纯度99.48 %，宝鸡辰光）；羧甲基纤维素钠（CMC-Na，美国Sigma-Aldrich公司）；甲醇，乙腈，乙酸铵为色谱纯级别；水为纯净水，其余试剂为分析纯。

1.3 实验动物

健康雄性SD大鼠，体重为200±20 g，由济南朋悦动物繁育公司提供，许可证号为SCXK（鲁）20140007。实验期间大鼠在恒定环境下饲养，相对湿度为55 %±15 %，饲养温度为23±3 ℃，日温差≤4 ℃，昼夜明暗交替时间10 h/14 h，并可自由饮食饮水。

2 方法与结果

2.1 桑辛素混悬液的配制

称取桑辛素粉末适量，置于10 ml量瓶中，加入适量0.5 %CMC-Na溶解，定容，配制成20 mg/ml桑辛素混悬液，临用前配制。

2.2 色谱条件

Agilent Extend C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 µm）；流动相：5 mmol/L乙酸铵水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱：0～2.0 min，10 % B；2.0～20 min，10 %B→95 %B；20～27 min，95 %B；27～27.1 min，95 %B→10 %B；27.1～30 min，10 %B；流速0.6 ml/min；柱温：35 ℃；进样量：5 µl。

2.3 质谱条件

离子源为电喷雾离子化源（ESI），负离子模式；质量扫描范围m/z100～1200；喷雾电压：3500 V，离子传输管温度：320 ℃，鞘气压力：45 arb；辅助气压力：10 arb。

2.4 样品采集

将4只SD大鼠随机分为空白组和给药组，每组 2只，实验前适应性喂养一周。给药组大鼠按20 mg/kg灌胃给予桑辛混悬液，置于代谢笼中，给药后2，4，8 h分别对各组进行眼眶取血，置于含肝素钠的EP管中， 4 ℃下、10 000 r/min离心5 min，取上层清液，放入-80 ℃冰箱备用。空白组大鼠灌胃等体积0.5 % CMC-Na溶液。将4只SD大鼠随机分为空白组和给药组，给药组大鼠按20 mg/kg灌胃给予桑辛混悬液，空白组大鼠灌胃给予等体积0.5 %CMC-Na溶液，置于代谢笼中，给药后分别收集0～6 h、6～12 h、12～24 h的尿液和0～12 h、12～24 h的粪便，放入-80 ℃冰箱保存。

2.5 样品制备方法

分别取大鼠给药后的不同时间点（段）的血浆、尿液、粪便样品，按AUC混合法（AUCpooling）原则进行样本混合。血浆：加3倍量甲醇，涡旋混合5 min后，13 000 r/min离心3 min，取上清。尿液：经15 000 r/min离心20 min后，取其上清。粪便：干燥后研磨成粉末状，称取100 mg，加入1 ml甲醇超声提取20 min，15 000 r/min离心10 min，取全部上清吹干后，加入流动相涡旋混合2 min，取上清，经0.22 μm 滤膜滤过，取 5 μl 进样分析。

2.6 对照品质谱分析

低碰撞能量质谱中，主要检测到桑辛素的[M-H]-离子（m/z419.1500），其保留时间为20.14 min。高碰撞能量质谱图中，主要碎片离子为m/z297.11，191.07，109.03，推测其可能的断裂途径见图2。

图2 桑辛素的主要裂解途径

2.7 含药样品超高效液相色谱-高分辨质谱（UPLC-HRMS）分析

利用Q-Exactive plus orbitrap质谱仪自带的Compound Discoverer 3.0.0.294软件，根据样品的一级、二级质谱图，并与相应的空白样品对比寻找潜在的代谢产物。结果显示大鼠灌胃给予桑辛素后，血浆中出现了4个主要的色谱峰。通过代谢物鉴定软件Compound Discoverer 3.0.0.294及Xcalibur数据采集功能，对上述 4个色谱峰进行定性分析，确证为原形M0和3个代谢产物M1，M2-1和M3[11-12]。尿液中出现了2个主要的色谱峰，通过代谢物鉴定软件及Xcalibur数据采集功能，对上述 2个色谱峰进行定性分析，确证为2个代谢产物M2-1和M3；粪便中出现了7个主要的色谱峰。通过代谢物鉴定软件及Xcalibur数据采集功能，对上述 7个色谱峰进行定性分析，确证为原形M0和6个代谢产物M1，M2-1～M2-3，M4和M5。见图3、表1。

表1 桑辛素的大鼠血浆、尿液和粪便推测代谢产物

图3 大鼠体内桑辛素代谢物的离子流色谱图

M1：保留时间为 16.36 min，m/z435.1449，比M0（m/z419.1500）多16，主要碎片离子m/z313.11，比原形桑辛素的子离子碎片（m/z297.11）多16。因此推测M1为羟基化代谢产物。

M2-1～M2-3：保留时间分别为13.09，10.41和1 3.4 3 m i n，m/z5 9 5.1 8 2 1，比M 0（m/z419.1500）多176，推测可能为葡萄糖醛酸化代谢产物。二级质谱产生特异性子离子m/z419.15，推测为葡萄糖醛酸化代谢产物脱去1分子葡萄糖醛酸产生碎片离子，此外3个代谢产物的子离子m/z297.11，与原形桑辛素的子离子一致，因此推测M2-1～M2-3为桑辛素的3个葡萄糖醛酸化代谢产物，葡萄糖醛酸化发生在3个羟基化位置，生成了3个同分异构体。

M3：保留时间为11.15 min，m/z611.1770，比M0（m/z419.1500）多192（16+176），主要碎片离子m/z435.15，与M1一致。因此推测M3为桑辛素的羟基化加葡萄糖醛酸化代谢产物。

M4：保留时间为 12.81 min，m/z451.1398，比M0（m/z419.1500）多32，主要碎片离子m/z329.10，比原形桑辛素的子离子碎片（m/z297.11）多32。因此推测M4为双羟基化代谢产物。

M5：保留时间为11.33 min，m/z517.1174，比M0（m/z419.1500）多98（2+16+80），主要碎片离子m/z435.15，与M1一致。因此推测M5为桑辛素的加氢还原加羟基化加硫酸化反应产物。

3 讨论

HRMS技术显著提高代谢物鉴定的准确度和分析通量，在天然活性成分代谢产物鉴定研究中起到不可替代的作用[13]。本课题组前期研究报道[14-15]，大鼠灌胃给予桑辛素和桑白皮提取物后，采用液相色谱-三重四级杆串联质谱评价了原形桑辛素在正常大鼠和糖尿病模型大鼠中的血浆药动学。目前对桑辛素的体内代谢研究很少。由于桑辛素分子结构中含3个酚羟基基团, 在负离子ESI模式下, 桑辛素易形成脱氢离子[M-H]-，其m/z419.15。本研究采用负离子模式鉴定桑辛素的代谢产物，采用UPLC-Q-Exactive plus orbitrap-MS技术，对桑辛素灌胃20 mg/kg后在大鼠血、尿、粪中的代谢产物进行了分析及鉴定。分析各代谢物的二级质谱图，通过与原形药物二级质谱图及质谱裂解规律进行比较，结合Compound Discoverer 3.0.0.294软件进行分子式的拟合，共鉴定了除原形药物之外的7个代谢产物，其中包括代谢物M2的3个同分异构体（M2-1～M2-3）。从代谢物的结构来看，原形药物在体内主要发生了羟基化和葡萄糖醛酸化等反应，其中代谢产物M2出现的同分异构体，可能是原形药物本身结构的原因，也可能是由于发生代谢反应时反应的位点不同。具体为血浆和粪便中除原形化合物外，还有羟基化产物和葡萄糖醛酸结合物。尿中未检出原形化合物，主要代谢物为原形的葡萄糖醛酸结合物（M2-1）和原形的羟基化+葡萄醛酸结合物（M3）。