乳酸菌发酵胡柚汁对小鼠肥胖的调节作用

颜 旭，王方杰，吴祖芳,*，翁佩芳

（1.宁波大学食品与药学学院，浙江 宁波 315211；2.浙江省动物蛋白食品精深加工技术重点实验室，浙江 宁波 315211）

随着人们饮食观念的改变和自我保健意识的增强，通过饮食调整促进自身健康的观念逐渐得到认同，绿色、天然、营养和保健成为人们选择食品的重要指标。益生菌发酵果蔬汁产品恰好迎合了现代人的需求，显示出较好的发展势头[1-2]。经过发酵，果蔬汁产品被赋予独特风味，产生了丰富的乳酸、氨基酸和短链脂肪酸等多种营养物质，赋予果蔬新的营养功能[3]。有研究报道，一种用乳酸菌发酵的果汁能够显著降低大鼠血液中胆固醇含量，可能是其中的乳酸菌在发酵过程中产生了一些活性物质所致[4]。发酵果蔬汁还有抗疲劳作用，同时还可以缓解腹泻对小鼠肠道黏膜的损伤，加强小鼠肠道屏障的防御功能[5]。

常山胡柚（Citrus paradisicv.Changshanhuyou）又名胡柚、金柚，是原产浙江省常山县的地方柑橘品种，是芸香科柑橘属的一个种，为酸橙与柚杂交的地方柑橘品种，仅浙江常山区目前年产量就达10万余吨，且种植面积还在不断扩大。胡柚果实因富含多种生物活性物质、具有较高的保健药用功能而受到广泛的关注[6-7]。经乳酸菌发酵后，发酵胡柚汁（fermented Huyou juice，FHJ）的挥发性风味化合物种类增加[8]；有机酸含量变化显著，总酚和总黄酮类化合物含量提高，自由基清除能力提高，显著改善了胡柚汁的品质和抗氧化特性[9]。目前，对益生菌FHJ的研究更多集中在加工工艺和品质方面，对其功能性的研究则鲜见报道。

为研究乳酸菌发酵胡柚汁对小鼠肥胖的调节作用，本实验利用C57/BL6J小鼠开展动物实验，通过饲喂高脂饲料诱导产生肥胖症状从而建立肥胖小鼠模型，并对肥胖小鼠进行FHJ饮食干预，通过考察小鼠的各项生理生化指标和组织中脂肪积累情况，研究乳酸菌FHJ对肥胖小鼠的降脂作用，为乳酸菌FHJ功能性评价和减肥机制提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

SPF级C57BL/6J小鼠（6 周龄，雄性，平均体质量（20±2）g）购于上海斯莱克实验动物有限公司（生产许可证号：SCΧK（沪）2017-0005）。

低脂（对照）饲料（TP23402，脂肪提供10%能量）、高脂饲料（TP23400，脂肪提供60%能量）购于南通特洛菲饲料科技有限公司，饲料主要成分见表1。

表1 高脂饲料和低脂饲料热量及成分Table 1 Calories and ingredients of high-fat and low-fat diets

新鲜胡柚购自浙江省常山县胡柚种植基地；植物乳杆菌L1（Lactobacillus plantarumL1）、发酵乳杆菌L2（Lactobacillus fermentumL2）由宁波大学食品与药学学院食品生物技术实验室保存。

总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（highdensity lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）试剂盒 南京建成生物工程研究所；苏木素-伊红染液、油红O染液、脂肪固定液 武汉谷歌生物科技有限公司；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS） 北京索莱宝科技有限公司；氯化钠、异丙醇、无水乙醇、盐酸、多聚甲醛 国药集团有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

AY-120型电子精密天平 日本Shimadzu公司； LDZΧ-50KBS立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂； HH-4型恒温水浴锅 江苏国华电器有限公司；Spectramax190全波长酶标仪 美国Molecular Devices有限公司；5804R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；MΧ-S/MΧ-F型漩涡混合器 大龙兴创实验仪器北京有限公司；JJ-12J脱水机、JB-P5包埋机 武汉俊杰电子有限公司；RM2016病理切片机 徕卡（上海）仪器有限公司；KD-P组织摊片机 金华市科迪仪器设备有限 公司；DHG-9140A烤箱 上海慧泰仪器制造有限公司；Cryotome E冰冻切片机 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；Eclipse CI正置光学显微镜 日本尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌发酵胡柚汁的制备

将新鲜胡柚进行清洗，去除果皮、囊衣和籽等不可食用部分，得到胡柚果肉。将果肉加水榨汁，过滤去渣后获得胡柚果汁。加入体系质量8%的白砂糖并搅拦均匀，在85 ℃下巴氏灭菌20 min，冷却至25 ℃。随后，将胡柚汁按照总体积的3%接种植物乳杆菌L1和发酵乳杆菌L2混合发酵剂（质量比为1∶1），接种后的果汁在37 ℃下发酵36 h，然后在4 ℃冰箱中静态放置12 h后熟，得到FHJ[9]。在相同条件下不进行接种作为对照，得到未发酵胡柚汁（non-fermented Huyou juice，NFHJ）。在动物实验开始前测定果汁中的活菌数，FHJ中的活菌数约为 109CFU/mL，而在NFHJ中未发现活菌。所得样品置于4 ℃下储存备用。

1.3.2 动物饲养条件及实验分组

在整个实验期间，所有涉及动物的实验程序均严格按照中国有关实验动物的使用和饲养规定在宁波大学实验动物中心进行（使用许可证号：SYΧK（浙）2013-0191）。 购得的小鼠经外包装灭菌处理立即放入动物房SPF级屏障系统内饲养，饲养环境温度22～24 ℃、相对湿度（50±10）%，光暗循环周期为12 h。小鼠在实验期间可以自由获得食物和水，垫料每3 d更换一次。

小鼠以高脂饮食适应性饲养7 d，然后均分为4 组，每组8 只小鼠：低脂饮食组（LFD组，饲喂低脂饲料， 灌胃10 mL/（kgmb·d）无菌水）（对照）、高脂饮食组（HFD组，饲喂高脂饲料，灌胃10 mL/（kgmb·d）无菌水）、高脂饮食+FHJ组（FHJ组，饲喂高脂饲料，灌胃10 mL/（kgmb·d）FHJ），高脂饮食+NFHJ组（NFHJ组，饲喂高脂饲料，灌胃10 mL/（kgmb·d）NFHJ）。根据人类肥胖和超重标准，将肥胖度大于10%视为超重，大于20%视为肥胖并认为肥胖模型建立成功。肥胖度按公式（1）计算[10-11]。实验以第一天灌胃记为第0周，共持续8 周，每周记录3 次小鼠的体质量和饮食量、饮水量并计算平均值。

1.3.3 小鼠脏器指标分析

第8周末，所有小鼠禁食过夜，通过颈椎脱臼处死小鼠，立即收集血液样本，放入EP管中，4 ℃静置30 min，再3 500 r/min离心10 min。取上层血清于干净的离心管中，分装3 管，置于4 ℃冰箱保存备用。迅速解剖小鼠，对小鼠的肝脏、心脏、肾脏、脾脏、附睾脂肪、腹腔脂肪、肾周脂肪进行称质量。按式（2）计算小鼠的肥胖指数，即白色脂肪（附睾脂肪、腹腔脂肪、肾周脂肪）质量与体质量的百分比。按式（3）计算小鼠各脏器指数。

称质量后，将新鲜肝脏组织用预冷PBS冲洗干净，取肝脏最大面，切成1 cm×1 cm×1.5 cm大小，置于体积分数4%多聚甲醛溶液中用于组织切片分析。剩余肝脏组织用于抗氧化指标的测定。将脂肪组织用预冷PBS冲洗干净，取附睾脂肪置于体积分数4%多聚甲醛溶液中。

1.3.4 血清生化指标和肝脏抗氧化指标的测定

小鼠血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C浓度及ALT、AST活力均采用相应试剂盒进行检测，测定方法严格按照试剂盒说明书进行。

取小鼠肝脏组织准确称质量，放入5 mL的匀浆管中，加入9 倍体积的匀浆介质PBS，冰水浴条件下用眼科小剪尽快剪碎组织块。将上述组织匀浆液2 500 r/min离心10～15 min，取上清液进行测定。小鼠肝脏中MDA含量和SOD、GSH-Px活力均采用相应试剂盒进行检测，测定方法严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.5 组织切片分析

将新鲜肝脏组织在体积分数4%多聚甲醛溶液中固定24 h后，用OTC包埋剂进行包埋。快速冷冻后切下组织切片（8～10 μm），并用油红O染色，在光学显微镜下放大200 倍观察肝脏脂肪变性程度。

附睾脂肪在体积分数4%多聚甲醛溶液中固定24 h，然后用一系列体积分数乙醇溶液（50%、70%、85%、90%、95%、100%、100%，各1 h）依次脱水，并包埋在石蜡中。切下组织切片（5～6 μm），并用苏木精-伊红染色。通过显微镜放大200 倍获得图像。

1.4 数据处理与分析

所有实验均进行3 次平行，数据结果表示为平均值± 标准差。运用统计软件SPSS 17.0进行单因素方差分析，采用Duncan’s多重比较检验，当P＜0.05时认为具有统计学显著差异。

2 结果与分析

2.1 小鼠饮食量、饮水量、体质量和脏器质量的变化

由图1可知，各组小鼠的日均饮食量和饮水量在实验周期内基本稳定，在8 周的实验周期内饮食量保持在3.5～6.0 g，LFD组、HFD组、FHJ组和NFHJ组小鼠的饮食量无明显差异；LFD组小鼠的饮水量整体高于HFD组，其他组的饮水量无明显差异，保持在每天5.0～7.3 mL。结果证明FHJ和NFHJ的摄入不会引起小鼠的食欲下降。

图1 FHJ灌胃期间小鼠日饮食量（A）和饮水量（B）的变化Fig.1 Changes in daily food intake (A) and water intake (B) of mice during administration of FHJ

对8 周实验期间各组小鼠的平均体质量进行比较。第0周时，模型小鼠的初始平均体质量为20.0 g。随着实验的进行，小鼠体质量呈现整体上升趋势。C57BL/6J肥胖小鼠模型建立成功的判断标准是高脂饮食组平均体质量高于对照组20%。由图2A可知，经过8 周的高脂饮食诱导，HFD组小鼠平均体质量是LFD组小鼠体质量的1.28 倍，具有极显著差异（P＜0.01），证明肥胖模型诱导成功。在FHJ和NFHJ的灌胃干预下，与HFD组相比，干预组小鼠的体质量呈现不同程度的下降。从第4周起，FHJ组的平均体质量显著低于HFD组（P＜0.05），第7周起具有极显著差异（P＜0.01）。而NFHJ组小鼠的体质量从第7周开始显著低于HFD组（P＜0.05）。

图2 FHJ灌胃期间小鼠体质量变化Fig.2 Changes in body mass of mice during administration of FHJ

由图2B可知，至第8周实验结束时，HFD组的体质量增量最多，为（11.45±0.65）g，与LFD组相比具有极显著差异（P＜0.01）。FHJ组的平均体质量增量为（6.49±0.32）g，与HFD组体质量增量相比极显著降低 （P＜0.01）。NFHJ组的平均体质量增量为 （8.34±0.37）g，与HFD组相比显著降低（P＜0.05）。实验结果表明，FHJ、NFHJ显著缓解了肥胖小鼠的体质量增加，且FHJ的效果更好。

如表2所示，灌胃8 周后，HFD组小鼠的肝脏质量为（1.12±0.25）g，相比LFD组显著增大（P＜0.05），FHJ组和NFHJ组小鼠的肝脏质量基本恢复至正常水平，由表3可知，与LFD组相比，其他3 组小鼠各个脏器指数均较低，这是因为HFD组的脂肪质量增量占体质量增量的比重更大，从而导致脏器指数的降低。各组小鼠的脏器脂肪质量具有明显差异，FHJ组和NFHJ组小鼠的附睾脂肪、腹腔脂肪、肾周脂肪质量均低于HFD组，经胡柚汁干预后，肥胖小鼠的白色脂肪总质量由HFD组的（2.73±0.25）g显著降低至FHJ组的（1.32±0.13）g （P＜0.05）以及NFHJ组的（2.16±0.12）g （P＜0.05）。由图3可知，HFD组小鼠的肥胖指数高达（8.72±0.26）%，与LFD组相比具有极显著差异 （P＜0.01），FHJ和NFHJ的摄入显著降低了小鼠的肥胖指数（P＜0.05）。因此，FHJ和NFHJ能够在一定程度上减少肥胖小鼠体内脂肪的累积。

表2 不同饮食对小鼠脏器质量的影响Table 2 Effects of different diets on visceral organ masses of mice

表3 不同饮食对小鼠脏器指数的影响Table 3 Effects of different diets on visceral organ indexes of mice

图3 不同饮食小鼠的肥胖指数Fig.3 Obesity indexes of mice consuming different diets

2.2 小鼠血清生化指标分析结果

由表4可知，与LFD组相比，HFD组小鼠的TC、TG和LDL-C浓度显著升高，HDL-C浓度显著下降 （P＜0.05），肥胖小鼠出现高血脂症状；同时HFD组小鼠的AST和ALT活力也显著升高，分别达到了（185.40±8.19）U/L和（109.50±5.08）U/L，证明长期高脂膳食对小鼠肝脏造成了一定的损伤。灌胃FHJ和NFHJ后，FHJ、NFHJ组与HFD组相比较，TC、TG和LDL-C浓度总体显著降低，HDL-C浓度显著升高（P＜0.05），其中TG和LDL-C浓度基本恢复至正常水平；AST和ALT活力也在FHJ和NFHJ的作用下明显降低，其中FHJ组的这两项指标分别降低至（156.70±8.17）U/L和（67.80±7.71）U/L， NFHJ组这两项指标分别降低至（169.10±9.23）U/L和（78.40±6.71）U/L。实验结果表明，FHJ和NFHJ的摄入能够显著降低肥胖小鼠的血脂水平，在一定程度上减轻长期高脂饮食造成的肝脏损伤，并且FHJ的效果 优于NFHJ。

表4 FHJ和NFHJ灌胃对小鼠血清生化指标的影响Table 4 Effects of FHJ and NFHJ on serum biochemical parameters in mice

在肥胖状态下，宿主会将体内非酯化的脂肪酸释放到循环系统中并在体内循环，从而提高TG水平，降低HDL-C水平，使血脂组成向LDL-C转变，增加动脉粥样硬化的风险[12]。而补充益生菌或益生元可以改善肥胖或超重人群的脂代谢，尤其能够显著降低TC和LDL-C水平[13-14]。这些观点可解释含大量活性乳杆菌的FHJ比NFHJ对血脂水平的调节作用更好。脂肪肝的形成与炎症反应增强有关，AST和ALT活力在肥胖脂肪肝形成早期会显著升高[15-16]。已有研究报道，某些乳杆菌能够通过降低血清中的TG水平和AST、ALT活力显著抑制小鼠的肥胖发展和脂质沉积[17]。FHJ的干预有效缓解了HFD小鼠肝脏的损伤，对脂肪肝及肝脏病变起到了积极的预防作用。

2.3 小鼠肝脏抗氧化指标分析结果

由表5可知，与LFD组相比，HFD组小鼠的MDA水平显著升高，SOD和GSH-Px活力显著下降（P＜0.05）。而FHJ组和NFHJ组的MDA水平相比HFD组明显降低，SOD和GSH-Px活力明显升高，但与LFD组比较也具有一定差异。

表5 FHJ和NFHJ灌胃对小鼠肝脏抗氧化指标的影响Table 5 Effects of FHJ and NFHJ on liver antioxidant indexes in mice

MDA是脂质过氧化的产物，其在机体内的含量变化能够定量反映生物膜的受损程度，并引发高血糖，研究证实肥胖患者体内MDA水平较高[18]。摄入FHJ和NFHJ均能够降低小鼠肝脏组织中的MDA水平，可能是因为胡柚中含有丰富的多酚、黄酮类化合物等抗氧化成分，且益生菌的发酵也增加了这些物质在胡柚汁中的含量[19]，这些成分在机体内显示出抗脂质过氧化的作用，从而减轻了氧化应激对肝脏的损伤。SOD能够作用于自由基，缓解其对机体细胞的损伤，抑制脂质的过氧化，而GSH-Px能够特异性催化还原型谷胱甘肽成为氧化型谷胱甘肽，从而保护细胞膜的结构和功能[20]。本实验团队前期测定了FHJ和NFHJ的体外抗氧化性指标，与NFHJ相比，FHJ对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基、超氧阴离子自由基和羟自由基的清除能力分别提高了4.3%、15.9%和0.7%以上[9]，FHJ的抗氧化作用可能与肥胖小鼠受损肝脏SOD和GSH-Px活性的恢复有关。

2.4 小鼠肝脏组织和脂肪细胞的切片分析结果

由图4A可知，LFD组小鼠的肝脏呈现红褐色，表面光滑，且肝脏的形态正常，而HFD组小鼠的肝脏体积偏大，颜色趋于浅红，颗粒粗糙且有油腻感，肝脏组织弹性较差。FHJ组、NFHJ组小鼠肝脏在色泽、表面光滑度、组织弹性等方面较HFD组具有明显改善。

图4 小鼠肝脏组织学观察（×200）Fig.4 Histological observation of liver tissue in mice (× 200)

由图4B可知，LFD组小鼠肝脏组织油红O染色面积较小，脂滴也很小，肝细胞形态正常；而HFD组肝脏组织中出现肝细胞脂肪变性，脂滴数目明显增多且呈堆积状，融合为大块的红色脂滴；相比之下，FHJ组肝脏切片红色脂滴体积明显减小，较为稀疏，呈小颗粒状不均匀分布，与正常肝脏组织的形态最为接近；NFHJ组肝脏切片中红色脂滴体积减小，但相对聚集成小片分布，肝细胞脂肪轻度变性。

肝脏是机体内脂类代谢的主要器官，摄入脂肪过多时，肝细胞会大量积累脂肪，甚至可能发生病变，形成脂肪肝[21-22]。实验结果表明，HFD组小鼠因持续摄入高脂饲料造成肝脏细胞脂质沉积严重，发生病变，而FHJ组和NFHJ组小鼠的肝脏脂质沉积在不同程度上得到了缓解，这一结果也与表4中AST、ALT的水平变化结果相一致。有研究证实，通过摄入乳杆菌能够显著减少HFD小鼠的体质量增加和病原菌的数量，减轻肝脏组织脂肪变性[23]。FHJ能够明显地抑制高脂饮食导致的肝脏组织脂质积累，降低肝脏脂肪变性程度，防止脂肪肝等肝脏病变的发生。

为了观察摄入胡柚汁对小鼠脂肪组织的影响，取小鼠附睾脂肪组织进行苏木精-伊红染色。由图5可看出，LFD组正常小鼠的细胞体积较小，大小均一、饱满，形态较为清晰。HFD组小鼠的细胞体积明显增大，呈大空泡状，细胞排列不规则，细胞膜不完全清晰，相交处可见融合现象。胡柚汁的干预使实验组小鼠脂肪组织细胞的体积出现了不同程度的恢复，FHJ组和NFHJ组细胞的形态基本上较规则且饱满，细胞体积减小，在视野范围内细胞数目明显增多，其中FHJ组的细胞体积更小。实验结果表明，摄入FHJ和NFHJ均能够抑制肥胖小鼠的脂肪组织脂质积累，改善脂肪细胞肥大，保护细胞形态，且FHJ的作用效果更好。这主要是因为新鲜胡柚汁中含有大量的生物活性化合物（主要有黄酮类、多酚类物质），这些活性化合物起到了主要的减脂作用。研究发现，多酚类物质进入体内会增加环腺甘酸的量从而刺激脂肪细胞的脂肪分解作用，加速脂肪细胞分解及转化，持续作用能使脂肪形成记忆，能自觉地抑制多余脂肪再积聚[24]。同时越来越多的证据表明乳酸菌等益生菌在能量平衡调节和体质量控制方面起到重要作用[25]。益生菌调节高脂饮食诱导小鼠的肥胖机制可能是益生菌可以改善致胖饮食的负面作用， 主要是通过与共生细菌相互作用改变涉及碳水化合物代谢和丁酸合成途径微生物代谢酶类的表达[26-27]。而益生菌发酵使果汁具有更完整的营养功能，本团队前期测定了发酵前后胡柚中总酚、总黄酮的含量，发现发酵后的胡柚中总酚、总黄酮含量显著增加[9]，这些活性成分保证了发酵果汁的高抗氧化能力，对血浆脂质代谢和肝脏抗氧化活性能够产生积极影响[28]。

图5 小鼠白色脂肪组织观察结果（×200）Fig.5 Histological observation of white adipose tissue in mice (× 200)

3 结 论

乳酸菌FHJ能够对肥胖小鼠发挥降脂作用，对肥胖症状产生积极的预防和缓解作用。摄入FHJ或NFHJ能够显著缓解肥胖小鼠的体质量增加，FHJ效果更好。摄入FHJ或NFHJ显著降低了肥胖小鼠的血清TC、TG和LDL-C浓度，提高了血清HDL-C浓度，可调节肥胖小鼠的血脂代谢；显著降低血清AST和ALT的水平，在一定程度上减轻了高脂饮食造成的肝脏损伤。摄入FHJ或NFHJ能够改善由肥胖导致的机体内抗氧化水平降低，能显著降低小鼠肝脏中的MDA水平，增强SOD和GSH-Px活性，有效改善肝脏氧化应激，提高肝脏抗氧化水平。FHJ能够在一定程度上减少脂肪在肝脏和其他组织、器官中的累积，改善肝脏脂肪变性程度和脂肪细胞肥大，防止脂肪肝等肝脏病变的发生。综上，本实验对开发果蔬汁乳酸菌发酵加工具有一定的参考意义和推动作用。