红毛丹果皮中老鹳草素的分离纯化及其热稳定性

李钰景，孙丽平，庄永亮*

（昆明理工大学农业与食品学院，云南 昆明 650500）

红毛丹（Nephelium lappaceumL.），又称毛荔枝，原产于马来西亚，我国云南省的西双版纳和海南保亭等地已发展种植[1]。红毛丹果实多汁多肉，可加工成水果罐头等产品；其果皮多为红色、披毛、易剥除，约占果实总质量的50%[2]。在东南亚，红毛丹果皮常用于抗菌和抗病毒感染，可用于治疗发烧、痢疾、腹泻等症状，是东南亚传统药物来源之一。

近几年来，本团队解析了红毛丹果皮多酚（rambutan peel polyphenols，RPP）的制取工艺、活性成分及其生物活性。研究发现，红毛丹果皮中酚类化合物含量高，可达果皮干质量的21%[3]；RPP中的主要物质成分为老鹳草素、柯里拉京、鞣花酸等[4]；其多酚提取物具有显著的抗衰老[5]、抗高糖应激损伤[6]、保护皮肤抵御光老化损伤[7]等生物活性，可提高大鼠抗维甲酸诱导的骨质疏松症的能力、保护RAW264.7细胞系不被破骨细胞分化因子诱导分化为破骨细胞等[8]。RPP对小鼠急性口服毒性的半数致死量大于5 000 mg/kgmb，在625 mg/kgmb的口服剂量下未对实验动物造成亚急性毒性[9]。红毛丹果皮作为产业废弃物，其酚类物质含量高、制取工艺简单、生物活性高等优异的性能吸引了越来越多研究者们的兴趣和关注[10-11]。

老鹳草素是一种鞣花单宁晶体，其分子结构中同时含有2 种类型的鞣花单宁取代基（六羟基联苯二酰基（hexahydroxydiphenoyl，HHDP）和去氢六羟基联苯二酰基（dehydrohexahydroxydiphenoyl，DHHDP）），其葡萄糖核上还连接一个没食子酸酰基。老鹳草素表现出显著的抗炎和抗骨质疏松活性，被认为是大戟科、苦木科、牻牛儿苗科等传统中草药-的活性物质基础[12]。

本实验基于前期的研究，以新鲜红毛丹为原料，拟探索从红毛丹果皮中快速提取高纯度老鹳草素的工艺，同时对纯化老鹳草素的热稳定性进行分析，对其降解产物进行表征，为红毛丹果皮高值化利用和红毛丹果皮多酚在食品、药物中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜红毛丹购于云南墨江县农贸市场。挑选果皮全红、无虫害的果实，依次将其用流动水和蒸馏水清洗后平铺于滤纸上自然晾干，收集果皮。

老鹳草素（标准品）（纯度＞98%） 上海源叶生物科技有限公司；甲醇、乙醇、乙腈（色谱纯） 德国默克公司；甲酸（色谱纯） 美国Sigma公司；无水乙醇、甲醇等为分析纯。

1.2 仪器与设备

LC-MS-8040型超高效液相色谱-三重四极杆质谱（ultra-high performance liquid chromatography triple quadruple mass spectrometry，UPLC-QqQ-MS）仪日本岛津公司；1260制备型高效液相色谱仪 美国安捷伦公司；Q-Exactive Focus型超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱（UPLC-quadrupole-Orbitirp-MS，UPLC-Q-Orbitirp-MS）、U3000分析型高效液相色谱仪 美国赛默飞公司；中压分离装置 瑞士步琦公司。

1.3 方法

1.3.1 红毛丹果皮干燥处理、干燥方式的优化

将收集的红毛丹果皮分成5 份，分别进行室温通风干燥（自然风干）、40 ℃鼓风干燥、60 ℃鼓风干燥、80 ℃鼓风干燥和真空冷冻干燥处理，待果皮至质量不再变化视为干燥完全。将5 种干燥方式得到的干燥果皮粉碎，过40 目筛，取筛下物于聚乙烯样品袋中于-20 ℃冻藏备用。

准确称取1 g果皮样品，加入100 mL体积分数60%乙醇溶液，超声时间10 min，离心（4 000 r/min、15 min），取上清液，得到果皮多酚提取液，真空冷冻干燥后得到多酚制取物，并称其质量，按公式（1）计算多酚制取物的产率。按Sun Liping等[3]的方法测定5 种方式干燥处理的果皮中总酚含量和体外抗氧化活性，按1.3.3节方法测定老鹳草素含量，优选果皮干燥处理方式。

1.3.2 老鹳草素的快速分离纯化

老鹳草素的快速分离纯化经过两个步骤实现：中压液相色谱反相C18柱系统和制备型高效液相色谱C18柱系统。

中压液相色谱反相C18柱系统初步纯化老鹳草素：以最优方式干燥处理的果皮粉为原料，得到多酚提取液，减压浓缩制成浸膏，根据m（果皮粉）∶m（硅胶）=1∶3的比例与细粒硅胶拦样，装柱，接入系统，利用甲醇-去离子水洗脱，按照每瓶200 mL定量分批接收洗脱流分。收集老鹳草素组分，减压浓缩得到中压分离组分，备用。C18柱系统分离洗脱条件：色谱柱：填料为反相C18材料，粒径30～50 μm，中压玻璃柱（36 mm×310 mm）；流动相A：去离子水；流动相B：无水甲醇；流速 20 mL/min；洗脱梯度：0～40 min，15% B；40～80 min，20% B；80～120 min，25% B；120～160 min，30% B；160～200 min：35% B；200～240 min，100% B。

制备型高效液相色谱纯化老鹳草素：将减压浓缩的老鹳草素组分用色谱纯甲醇稀释，采用Shimadzu C18制备型色谱柱（250 mm×20 mm，5 μm）分离，流动相为体积分数15%甲醇溶液，流速为10 mL/min。收集老鹳草素组分，减压浓缩后得到制备型液相色谱组分，冻干备用。

1.3.3 老鹳草素的定量分析

采用UPLC-QqQ-MS法对红毛丹果皮多酚制取物 及分离纯化组分中的老鹳草素进行定量分析。色谱分离和洗脱条件：Infinity Lab Poroshell 120 ECC18柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流动相A：体积分数0.1%甲酸溶液，流动相B：乙腈；梯度洗脱：0～1 min，5% B；1～5 min，5%～15% B；5～10 min，15%～38% B；10～15 min，38%～65% B；15～18 min，65%～80%B；18～20 min，80%～100% B；20～22 min，100% B；流速为 0.2 mL/min，进样体积为2.0 μL；柱温箱温度为35 ℃。

质谱条件：电喷雾电离（electron spray ionization，ESI）源，采用负离子模式，雾化气流为3 L/min；传输线温度250 ℃；加热块温度350 ℃；干燥气流15 L/min。以老鹳草素标准物质的质谱信息进行定性和定量，分析计算果皮中老鹳草素的含量，并按公式（2）～（4）分别计算老鹳草素产率、纯度、回收率。

式中：m1为组分中老鹳草素质量/mg；m2为果皮原料的干质量/mg；m3为组分干物质质量/mg；m4为这一步纯化前老鹳草素的质量/mg。

1.3.4 老鹳草素热稳定性分析

将纯化后的老鹳草素溶于色谱乙醇中，配制成300 mg/L溶液，置于60 ℃和100 ℃的水浴锅中加热10 h，每2 h取样。加热前后的样品体系采用UPLC-Q-Orbitrap-MS进行定性分析。色谱分离和洗脱条件同1.3.3节。质谱条件：ESI-离子源，扫描范围m/z100～1 000； 喷雾电压3.5 kV、毛细管传输温度320 ℃、干燥器温度350 ℃；一级和二级质谱的分辨率分别为70 000 和35 000。

1.4 数据处理与分析

每个实验至少3 次重复，使用Microsoft Office Excel 2016软件进行数据处理，采用SPSS 22.0软件对数据进行方差分析，P＜0.05表示差异显著；UPLC-Q-Orbitrap-MS测定数据采用Thermo Χcalibur Qual Browser软件进行定性分析。

2 结果与分析

2.1 干燥方式对红毛丹果皮总酚含量、老鹳草素含量 及抗氧化活性的影响

如表1所示，5 种干燥方式对红毛丹果皮中总酚含量、老鹳草素含量及其的体外抗氧化活性有显著影响。 真空冷冻干燥的红毛丹果皮中总酚含量最高，可达278.33 mg/g，显著高于其他4 种干燥方式处理的果皮；其老鹳草素含量为12.67 g/100 g，显著高于自然风干、40 ℃鼓风烘干和80 ℃鼓风干燥的果皮，但与60 ℃鼓风干燥的果皮中老鹳草素含量（12.07 g/100 g）没有显著性差异。在抗氧化活性方面，冷冻干燥果皮抗氧化活性最高，其次是60 ℃鼓风干燥的红毛丹果皮，且60 ℃鼓风干燥的红毛丹果皮1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力和抑制脂质体过氧化能力均与冷冻干燥红毛丹果皮无显著差异。

表1 5 种干燥方式处理对红毛丹果皮总酚含量、老鹳草素含量 及抗氧化活性的影响Table 1 Effects of five drying processes on total phenolic content, geraniin content and antioxidant activity of rambutan peel

2.2 老鹳草素的分离纯化结果

基于总酚含量及其制取物的抗氧化活性，结合真空冷冻干燥技术对物料品质保持的优势[13]，本实验选用真空冷冻干燥的红毛丹果皮作为多酚和老鹳草素制取原料。经测定，真空冷冻干燥红毛丹果皮多酚制取物的产率为54.34%（以果皮干质量计），多酚制取物中总酚含量为537.00 mg/g，老鹳草素含量为320.90 mg/g。 Palanisamy等[14]采用乙醇对40 ℃鼓风干燥的红毛丹果皮进行振荡提取，制取物产率为17.8%，总酚含量为762 mg/g，与本次实验结果略有差异，可能是原料品种、干燥方式、提取方式的不同导致的。本团队在前期研究中，采用大孔树脂对红毛丹果皮多酚制取物进行纯化，纯化前后总酚含量分别为579.72 mg/g和877.11 mg/g[4]。

采用中压液相色谱系统和制备型高效液相色谱系统探索红毛丹果皮多酚制取物中老鹳草素的快速分离纯化技术，结果如表2所示。经过中压液相色谱C18柱系统分离和纯化，再经UPLC-QqQ-MS系统进行定量分析，老鹳草素纯度为59.76%，回收率为85.70%。将收集的老鹳草素组分采用制备型液相色谱系统纯化，洗脱的老鹳草素纯度为95.63%，回收率为47.32%，最终得到的纯化后老鹳草素的产率为6.00%。

表2 红毛丹果皮中老鹳草素纯化的定量分析结果Table 2 Summary of purification of geraniin from rambutan peel

2.3 老鹳草素热稳定性研究结果

热处理可显著影响老鹳草素的稳定性，结果如图1 所示。60 ℃处理10 h，老鹳草素质量浓度从加热前的304.48 μg/mL下降至252.31 μg/mL，损失了17.13%。100 ℃加热2 h的过程中，老鹳草素快速降解，其损失率可达73.97%，加热10 h时未检出老鹳草素。研究认为鞣花单宁结构不稳定，其在液体环境中极易被碱、温度、光照、酶、微生物等因素破坏，降解产生一系列的同源衍生物[15]。Sójka等[16]研究了覆盆子鞣花单宁Lambertianin C 和Sanguiin H-6混合物在不同pH值和不同温度下的稳定性，研究发现，温度对覆盆子鞣花单宁稳定性的影响最大，在中性和弱碱性下，60～80 ℃的温度即可快速破坏覆盆子鞣花单宁的原体结构。

图1 热处理对老鹳草素稳定性的影响Fig.1 Effect of heating treatment on the stability of geraniin

对纯化后老鹳草素进行加热处理，利用UPLC-QOrbitrap-MS在降解体系中主要鉴定出7 种化合物，其具体离子碎片信息见表3。根据这6 种化合物的二级碎片离子的m/z，对比MassBank数据库信息、文献[16]，确定这6 种化合物分别为六羟基联苯二甲酸、没食子酸、云实酸、柯里拉京、Galloyl-bis-HHDP-glucose、鞣花酸、云实素。

表3 老鹳草素产品分解产物定性结果Table 3 Qualitative analysis of geranin decomposition products

老鹳草素的热降解产物均为酚类物质，根据降解产物，推测其热降解过程如图2所示。老鹳草素D-吡喃葡萄糖核上的“O-5”键水解，可生成没食子酸；葡萄糖核上酯化的HHDP水解后再经分子内酯化生成鞣花酸。老鹳草素可水解去掉DHHDP结构生成化合物柯里拉京，DHHDP结构可经过苯甲酸重排形氧代环戊烷甲酸结构的中间产物[12]，经脱羧、降解和分子内酯化形成化合物云实酸，云实酸脱羧形成云实素[16]。

图2 老鹳草素热降解过程及产物Fig.2 Thermal degradation process and products of geraniin

3 讨 论

近年来，真空冷冻干燥技术在食品干制方面表现出诸多优势，如可最大程度保留物料原有的结构、形状、色泽、风味、营养性和功能性物质成分等，其干制产品具有较好的复水性等，被认为是保持食品品质最好的方法[13]。 但是常规的真空冷冻干燥速度缓慢、耗能成本高[17]。 从新鲜原料干制角度，60 ℃鼓风干燥技术设备简单易实现、运行成本低，也可以作为原料的干燥方式。后期研究可探讨60 ℃鼓风干燥果皮中老鹳草素的制取、纯化和稳定性等技术和性质。

基于红毛丹果皮富含酚类物质及其表现的显著生物活性，Hernández-Hernández等[18]和Rakariyatham[2]等先后详细论述了红毛丹果皮生物活性的物质基础，分析了其对人体的健康促进作用，探讨了其在食品和医药产业中应用的可能性，强调了老鹳草素的存在及其生物作用。对于红毛丹果皮中的老鹳草素，Thitilertdecha等[19]采用Sephadex LH-20型填料柱层析技术对红毛丹果皮甲醇制取物进行组分分离，监测并收集得到富含鞣花酸、柯里拉京和老鹳草素的组分。Palanisamy等[20]采用LiChroprep RP-18填料柱层析技术和制备型液相色谱技术对红毛丹果皮甲醇制取物中的老鹳草素进行分离纯化，老鹳草素产率为3.79%。Perera等[21]采用C18型反向填料柱层析技术对红毛丹果皮中老鹳草素进行分离纯化，纯化后组分采用低温结晶处理，得到纯度接近98%的老鹳草素产品，产率为4.97%。本实验基于已有的研究，研究了中压C18柱系统联合制备型液相色谱对红毛丹果皮多酚制取物中老鹳草素的分离纯化技术。比较上述相关研究，本方法的一次处理量、处理时间、产品纯度与前人研究相当，但是老鹳草素产率更高。

目前普遍认同植物单宁是指相对分子质量在500～3 000之间的水溶性多酚类化合物，具有显著的生物活性，在医药、食品、日用化工等领域具有较高的应用预期[22]。鞣花单宁是分布广、种类多、生物活性显著的一大类植物丹宁，通过摄入蔬菜和水果，人体日均膳食鞣花单宁类物质为4～12 mg[23]。对于鞣花单宁在液体环境中的稳定性，Tanaka等[12]研究了老鹳草素在弱碱性环境下乙腈溶液中的稳定性，鉴定了柯里拉京、云实酸衍生物、云实酸等降解产物，并揭示了鞣花单宁与降解产物之间的转化关系。有研究表明，尽管鞣花酸被认为是鞣花单宁的水解产物，但鞣花单宁水解体系中鞣花酸的最大浓度可随原体中没食子酰基含量的增加而增加，而不是随着HHDP基团含量的增加而增加[16]。由此可推测，鞣花单宁 降解产生的没食子酸可能会发生氧化偶联反应，生成六羟基联苯二甲酸，再经过分子内酯化生成鞣花酸[16]。值得注意的是，鞣花单宁在光、热、酸碱等影响因素下，其降解产物的生物安全性也是需要探讨的[24]。

尽管鞣花单宁具有显著的生物活性，但是鞣花单宁原体一般不能被生物体直接吸收利用，最终分布于组织及血液中的浓度往往低于其发挥生物学功能的有效浓度，从而阻碍其在生产上的应用性[25]。鞣花单宁和鞣花酸的生物利用度较低，部分未被吸收的鞣花酸可在哺乳动物胃肠道菌群的作用下代谢为更易吸收的尿石素类物质[26]，并被认为是鞣花单宁和鞣花酸在体内发挥生物活性的物质基础[27]。有研究合成并表征了尿石素系列物的生物活性，发现具有邻苯二酚结构的尿石素C具有与老鹳草素、柯里拉京和鞣花酸相当的DPPH自由基清除 活性[28]，不具有邻苯二酚结构的尿石素A表现出显著的氧自由基吸收能力[29]，也可证实尿石素系列物是鞣花单宁在体内发挥生物活性的物质基础。老鹳草素作为典型的鞣花单宁，其相对分子质量为952，鉴定出的其热降解产物均是相对分子质量更低的生物活性酚类物质，提示可进一步研究其可控降解手段，特别是关注其在生物肠道代谢过程中的形态变化和跨膜行为[30]，这对于富含鞣花单宁的红毛丹果皮酚类制取物的科学合理利用具有重要意义。

4 结 论

本研究从新鲜红毛丹果皮出发，探讨了原料的干燥方式对总酚、老鹳草素含量及其制取物体外抗氧化活性的影响，工艺简单可行、耗能成本低的60 ℃鼓风干燥可以作为原料干制的有效方法。红毛丹果皮多酚制取物经中压液相色谱C18柱系统和制备型高效液相色谱分离和纯化可得纯度为95.63%的老鹳草素产品，产率为6.00%。纯化的老鹳草素不耐高温，鉴定出的热降解产物均是分子质量更低的生物活性酚类物质。本研究为红毛丹果皮富含的可水解鞣花单宁老鹳草素的开发和利用提供了技术支持和理论基础。后续研究可进一步对纯化后老鹳草素的可控降解及其生物有效性进行探讨。