黑加仑果实降解多糖理化特性、结构 及体外降血糖活性

徐雅琴，杨海红，李大龙，陈 哲，王丽波，杨 昱,*

（1.东北农业大学文理学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.东北农业大学园艺园林学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

近年来，植物多糖因其广泛的生物活性、功能性和低毒性而备受关注[1-3]。多糖的生物活性与其分子质量和结构等密切相关[2,4-5]。天然多糖大多分子质量大、水溶性差，限制了其在体内发挥生理作用[2,3,6]。研究表明，通过降解手段降低多糖的分子质量可有效提高多糖生物活性[2,6]。

目前多糖降解方法主要包括化学降解（氧化降解、酸解等）、物理降解（超声波降解、辐射降解、高压降解等）和酶解[2-3,7-8]。其中H2O2氧化降解法和超声波降解法具有高效、反应条件温和等优点，被广泛应用于多糖的降解中。超声辅助氧化降解可以将两种方法的优势结合，协同发挥作用。如Li Junhui等利用超声辅助VC-H2O2法制备低分子质量果胶多糖，结果表明超声提高了 VC-H2O2反应体系对果胶分子的降解效率，其主要通过增加自由基数量、降低化学反应的活化能及超声波的机械效应实现[9]。此外，研究表明超声辅助氧化降解法没有改变多糖的主要结构，但能够有效降低多糖分子质量，提高多糖生理活性[9-11]。

黑加仑作为一种有益健康的小浆果，含有多糖、多酚（花色苷、黄酮、酚酸等）和各种有机酸等活性 物质[12]。研究表明黑加仑果实含有不同组分的多糖，不同提取方法得到的多糖组分也不同[8,13-14]；同时，黑加仑果实多糖具有抗氧化、降血糖、抗病毒、抗肿瘤等多种药理活性[8,13]。本课题组前期针对热水提取及复合酶提取得到的黑加仑果实多糖存在分子质量较大、水溶性差的问题，分别采用超声波和Fe2+-H2O2法对黑加仑果实多糖进行了降解，结果显示经降解处理后，黑加仑果实多糖分子质量明显降低，抗氧化活性显著提高，而其主要结构没有发生变化[13,15]。因此，采用适当的方法对黑加仑果实多糖进行降解是改善其生物活性的有效手段。目前，关于超声波辅助Fe2+-VC-H2O2法对黑加仑多糖进行降解还鲜见文献报道，且黑加仑多糖某些功能特性如吸湿和保湿性能也鲜见研究。故本实验以微波辅助溶剂法提取得到的高分子质量黑加仑果实多糖为原料，利用超声波辅助Fe2+-VC-H2O2法降解，并对两种降解多糖的理化特性、结构及体外降血糖活性进行研究。以期拓宽黑加仑多糖的应用范围，并为进一步探究多糖和结构之间的构效关系提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

‘黑丰’黑加仑果实由黑龙江省农科院牡丹江农科所提供，果实清洗并真空包装后，置于-20 ℃冰箱冷冻保存。

D4006大孔吸附树脂 南开大学化工厂；琼脂糖凝胶Sepharose 6B、对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG） 上海源叶生物科技有限公司；阿卡波糖 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；葡聚糖标准品 北京拜尔迪生物公司；α-葡萄糖苷酶（100 U/g） 美国Sigma-Aldrich公司；α-淀粉酶（3 700 U/g） 北京博奥拓达科技有限公司。

1.2 仪器与设备

XH-800C电脑双控微波消解仪 北京祥鹄科技发展有限公司；TU-1901紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器公司；7890B气相色谱仪 美国Agilent公司；JY92-IIV超声波细胞破碎仪 宁波新芝生物科技股份有限公司；ALPHA-T傅里叶变换红外光谱仪 德国Bruker公司；2695/2414高效液相色谱仪 美国Waters 公司；AVANCEIII 500 MHz核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）波谱仪 德国Bruker公司；STA 449/F5同步热分析仪 耐驰科学仪器商贸（上海）有 限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑加仑果实降解多糖的制备

采用课题组前期方法[8]，以黑加仑果实为原料，微波辅助溶剂法提取多糖，经D4006大孔树脂初步纯化后，得到黑加仑果实多糖。将4.0 mL H2O2（1 mol/L）、4.0 mL VC（1 mol/L）和0.5 mL FeSO4加入到25.0 mL多糖溶液（2.0 mg/mL）中。混合液置于超声波细胞粉碎仪中，且超声探头浸没于液面2 cm处。在超声功率600 W下，分别超声40 min和60 min。超声后的多糖溶液经去离子水透析（透析膜截留分子质量3 500 Da，透析72 h），真空浓缩、冻干，得到两种降解粗多糖。

将两种降解多糖配制成15.0 mg/mL的溶液，负载在Sepharose 6B（2.6 cm×60 cm）柱上纯化。以去离子水为洗脱剂，上样量为1.0 mL，洗脱流速为0.8 mL/min。洗脱液每管收集1 mL，绘制洗脱曲线。 采用苯酚-硫酸法测定洗脱液的吸光度，通过吸光度跟踪检测多糖含量[16]，收集主要多糖组分，经浓缩、冻干后，得两种纯化降解多糖DP-1和DP-2。利用公式（1）计算多糖的质量分数。

式中：ρ为苯酚-硫酸法测定的多糖质量浓度/（mg/mL）；V为样品溶液体积/mL；m为冻干样品的质量/mg。

1.3.2 降解多糖理化性质测定

1.3.2.1 pH值、粒径和溶解度测定

配制质量浓度为1.0 mg/mL的多糖溶液，室温下利用pH计测定其pH值。将20.0 mg降解多糖溶于适量去离子水中，离心后取上清液，25 ℃下利用动态光散射粒度检测分析仪测定粒径。参考Chen Jialun等的方法[17]测定降解多糖的溶解度。

1.3.2.2 分子质量测定

采用高效液相色谱法测定降解多糖的分子质量。首先，以不同分子质量（T-10、T-40、T-70、T-110和T-2000）的葡聚糖为标准品配制溶液（2.0 mg/mL）。溶液经0.45 μm过滤器过滤后进样，进样量为10 μL，以超纯水为流动相，流速为0.6 mL/min，测定保留时间。根据保留时间与分子质量，利用GPC软件拟合得到标准曲线。相同条件下，测定多糖溶液（2.0 mg/mL）的出峰时间，根据标准曲线计算DP-1和DP-2的分子质量。

1.3.2.3 单糖组成分析

根据文献[14]测定多糖中单糖组成。将40.0 mg多糖样品溶解在2.0 mL三氟乙酸（2.0 mol/L）溶液中，110 ℃条件下水解4 h。将酸水解后的样品和单糖标准品进行乙酰化，利用气相色谱仪进行检测。

1.3.3 热稳定性分析

采用同步热分析仪分析降解多糖的热行为。在流速为50 mL/min的N2中进行，升温速率为10 ℃/min，测定温度范围为30～600 ℃。

1.3.4 吸湿性与保湿性测定

1.3.4.1 吸湿性

多糖吸湿性测定参考文献[6]并稍加修改。多糖在105 ℃的烘箱条件下，烘干至恒质量，并在干燥器中室温冷却。准确称取100.0 mg多糖于干燥的培养皿上，将其放置于相对湿度为81%的干燥器中（干燥剂为饱和硫酸铵）。室温条件下每隔1 h称量1 次质量（共进行13 h），以甘油为阳性对照。通过公式（2）计算吸湿率。

式中：mt为时间t后样品质量/mg；m0为质量恒定的样品质量/mg。

1.3.4.2 保湿性

将1.3.4.1节中吸水达到饱和的样品放置于装有硅胶的干燥器中，室温下进行保湿实验，每隔1 h称量1 次质量（共进行10 h），按公式（3）计算保湿率。

式中：m为吸水达到饱和的样品质量/mg；mt为时间t后的样品质量/mg；m0为质量恒定的样品质量/mg。

1.3.5 降解多糖的结构表征

1.3.5.1 傅里叶变换红外光谱分析

采用KBr压片法对多糖进行压片处理，在4 000～ 500 cm-1范围内，利用傅里叶变换红外光谱仪对两种降解多糖进行红外光谱扫描。

1.3.5.2 高碘酸氧化分析

高碘酸氧化分析参考文献[18]的方法并略作修改。将30.0 mg多糖溶于30.0 mL高碘酸钠溶液（15.0 mmo1/L） 中，在室温条件下避光反应。每隔6 h取0.1 mL反应溶液，用去离子水定容至25.0 mL。用紫外分光光度计测定223 nm波长处吸光度，待吸光度稳定后加入乙二醇终止反应。根据高碘酸钠浓度-吸光度标准曲线，计算得到消耗高碘酸钠物质的量。以酚酞为指示剂，用0.008 0 mol/L氢氧化钠溶液滴定反应溶液，计算生成的甲酸物质的量。

1.3.5.3 NMR分析

将20.0 mg多糖用D2O溶解于NMR管中，在500 MHz NMR仪中进行1H-NMR和13C-NMR测定。

1.3.6α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定

参考文献[13]，测定不同质量浓度（0.2～2.0 mg/mL） 的多糖样品对α-淀粉酶（底物为淀粉）和α-葡萄糖苷酶（底物为pNPG）的抑制活性，以阿卡波糖作为阳性对照。按公式（4）计算α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率。

式中：Aa为样品实验组的吸光度（样品+酶+底物的吸光度）；Ab为样品对照组的吸光度（样品+底物的吸光度）；Ac为空白实验组的吸光度（酶+底物的吸光度）；Ad为空白对照组的吸光度（底物的吸光度）。

1.3.7α-淀粉酶抑制动力学分析

参考文献[8]，采用Lineweaver-Burk双倒数方程研究降解多糖对α-淀粉酶的抑制动力学，确定降解多糖的抑制类型，并通过双倒数曲线计算Ki值。

1.4 数据处理与分析

所有实验数据均以3 次实验结果的平均值±标准差表示。SPSS 18.0软件进行统计学分析，以P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 降解多糖的理化性质

由表1可知，DP-1和DP-2多糖质量分数接近，并且都是酸性多糖。同DP-1相比，DP-2的分子质量降低了17.05%，且平均粒径较小。超声降解和氧化（Fe2+-VC-H2O2） 降解具有协同作用，超声波可以促进Fe2+催化VC-H2O2体系产生更多·OH，该自由基会进攻多糖链，经过一系列化学反应，导致糖苷键断裂，分子质量降低[7,9,11]。 两种降解多糖均由6 种单糖构成，不同单糖相对含量不同，表明超声波辅助Fe2+-VC-H2O2法降解没有改变多糖的组成。此外，DP-1和DP-2的溶解度分别为 （24.50±0.02）mg/mL和（26.30±0.03）mg/mL，高于原黑加仑果实多糖的溶解度（（19.30±0.03）mg/mL）[8]， 由此可见，超声波辅助Fe2+-VC-H2O2降解提高了多糖的溶解度。

表1 DP-1、DP-2的理化性质Table 1 Physicochemical properties of DP-1 and DP-2

2.2 降解多糖的热重分析结果

热重分析（thermogravimetric analysis，TGA）曲线如图1所示，DP-1和DP-2的TGA曲线类似，主要分为3 个阶段。第一阶段（30～150 ℃），多糖质量损失较小，约为7%，主要来自多糖自由水和结合水的蒸发。第二阶段（150～430 ℃），多糖出现明显的质量损失，在该阶段中 DP-1、DP-2的质量损失率分别为56.09%和57.28%，其中DP-1和DP-2开始降解的温度分别为178.12 ℃和188.64 ℃（质量损失率达到10%时的温度）。此阶段质量明显减少归因于多糖链的热分解，从而产生气体或者发生碳化，包括羧基脱羧反应和糖链断键等[19]。第三阶段（430～600 ℃），多糖的质量损失减缓，DP-1、DP-2质量分别减少了7.87%和6.56%。最终，DP-1和DP-2总质量损失分别为71.32%和70.72%，均略低于原黑加仑果实多糖（71.92%）[8]。研究发现，从室温升高到590 ℃，白色和黄色羽扇豆多糖总质量损失率分别为78.21%和74.75%[20]；而从25 ℃升高至180 ℃鹰嘴豆壳多糖质量损失率为73.30%[21]，均高于黑加仑降解多糖热重损失。因此，两种黑加仑降解多糖具有一定的热稳定性。

图1 DP-1和DP-2的TGA曲线Fig.1 Thermogravimetric analysis curves of DP-1 and DP-2

2.3 降解多糖的吸湿性和保湿性分析结果

由图2A可知，多糖和甘油的吸湿率随着时间延长而增大，在5 h之前DP-2的吸湿率明显高于DP-1和甘油。11 h时DP-1和DP-2吸湿能力趋于饱和，吸湿率分别为（51.90±1.76）%和（66.08±1.63）%，明显低于甘油（（92.65±1.71）%）。由图2B可知，多糖及甘油的保湿率随时间的延长而下降。总体上，甘油的保湿效果优于DP-1和DP-2。在10 h时DP-1、DP-2和甘油的保湿率分别为（30.73±1.03）%、（37.14±0.93）%和（52.25±0.49）%。多糖具有吸湿与保湿能力主要是由于多糖分子中存在的羟基、羧基等亲水基，这些基团可与水分子形成氢键，从而达到吸湿和保湿的效果[6,22]。此外，多糖分子间相互交缠形成的网络结构对其保水性也具有重要影响[23]。

图2 DP-1和DP-2的吸湿（A）与保湿（B）能力Fig.2 Moisture absorption (A) and retention (B) capacity of DP-1 and DP-2

2.4 降解多糖的结构表征结果

2.4.1 傅里叶变换红外光谱分析结果

两种多糖的傅里叶变换红外光谱见图3，多糖DP-1和DP-2的红外谱图类似，在4 000～500 cm-1范围内均具有明显的多糖特征吸收峰。在3 403.40、2 901.61 cm-1和1 726.51 cm-1处的吸收峰归因于O—H、C—H和C＝O伸缩振动[14]。1 608.86 cm-1和1 427.42 cm-1附近的吸收峰归因于COO-的伸缩振动，说明两种多糖中含有糖醛酸[8,24]。 此结果和气相色谱测定结果一致。1 097.14 cm-1和1 017.76 cm-1处对应的强吸收峰证明存在吡喃糖苷[4,13]。此外，在908.61 cm-1和820.73 cm-1处的吸收峰表明存在α-和β-型糖苷键[8,25]。

图3 DP-1和DP-2的傅里叶变换红外光谱图Fig.3 FTIR spectra of DP-1 and DP-2

2.4.2 高碘酸氧化分析结果

通过标准曲线计算和滴定分析结果可知，多糖DP-1和DP-2分别消耗0.164 mmol和0.167 mmol的高碘酸，并且生成了0.068 mmol和0.070 mmol的甲酸，高碘酸的消耗量是甲酸生成量的两倍多。这些结果证明，降解多糖中存在1→或1→6、1→2或1→2,6、1→4或1→4,6连接的糖苷键[1,18]。

2.4.3 NMR光谱分析结果

由图4A、B可知，DP-1和DP-2的NMR光谱图相似，信号峰主要集中在δH3.0～5.3和δC60.0～110.0，属于多糖信号峰。两种多糖在δH4.0～5.3和δC90.0～110.0出现的异头信号表明其均存在α-和β-构型的糖苷键[2,8]，这与红外光谱得到的结果一致。由1H NMR和13C NMR谱图可知DP-1和DP-2 H1/C1的化学位移。DP-1 H1/C1的化学位移为5.10/109.21、5.18/98.22、5.01/98.01、4.82/100.34、4.55/107.47、4.50/103.39；DP-2 H1/C1的化学位移为5.10/108.31、5.18/99.07、5.01/98.04、4.82/102.98、4.55/105.56、4.50/103.22。可见异头信号的化学位移相近，推测两种多糖有相同的糖残基。此外，在δC170附近的信号峰表明糖链中存在糖醛酸。在参考相关文献的基础上，依据异头碳和氢的化学位移及高碘酸氧化分析结果，推测这两种多糖含有相同的6 种糖残基，分别为→3)-α-L-Araf-(1→[8]、→2)-α-L-Rhap-(1→[4,26]、→4)-α-DGalAp-(1→[8,27]、→4)-β-D-Manp-(1→[1]、→6)-β-DGalp-(1→[28]和→3,6)-β-D-Glcp-(1→[5]。

图4 DP-1和DP-2的核磁共振谱图Fig.4 NMR spectra of DP-1 and DP-2

2.5 降解多糖对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性

α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制剂可抑制淀粉、糖原等水解成葡萄糖，延缓淀粉、糖原等在小肠中的吸收，降低餐后血糖水平[8,29]。因此，作为口服降糖药物，天然的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制剂引起了人们广泛的关注。DP-1和DP-2对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用如图5所示，多糖质量浓度在0.2～1.0 mg/mL的范围内增加，对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制率增加。而当多糖质量浓度从1.0 mg/mL增加至2.0 mg/mL 时，抑制率变化较小且趋于稳定。多糖质量浓度为 2.0 mg/mL时，DP-1、DP-2和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率最高，分别为（67.45±3.45）%、（73.22±0.48）%和（89.92±2.26）%，半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分别为0.63、0.48 mg/mL和0.23 mg/mL。 多糖质量浓度为2.0 mg/mL时，DP-1、DP-2和阿卡波糖对α-淀粉酶抑制率最高，分别为（64.74±2.08）%、（73.28±2.52）%和（76.86±1.65）%，IC50分别为0.33、0.24 mg/mL和0.17 mg/mL。可见两种多糖对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶有较明显的抑制作用，但均低于阿卡波糖。多糖DP-1和DP-2对两种酶具有抑制作用，主要是这两种多糖糖链上含有羟基和羧基，可以和消化酶的氨基酸残基结合，从而抑制酶的活性[30]。阿卡波糖是一种治疗餐后高血糖症的临床药物，但阿卡波糖治疗经常伴有如腹胀和腹泻[29,31]等副作用。

图5 DP-1和DP-2对α-葡萄糖苷酶（A）和α-淀粉酶（B）的抑制作用Fig.5 Inhibitory effects of DP-1 and DP-2 on α-glucosidase (A) and α-amylase (B)

2.6 降解多糖对α-淀粉酶抑制动力学

多糖对α-淀粉酶抑制作用的双倒数曲线（Lineweaver-Burk）见图6A、B。随多糖质量浓度的增加 （0～1.0 mg/mL），曲线与纵坐标截距保持不变，表明vmax保持不变；而米氏常数Km（x轴截距的负倒数）随多糖质量浓度增大而增大。因此DP-1和DP-2对α-淀粉酶为竞争型抑制[8,29]。根据竞争性抑制动力学方程[32]可得，DP-1和DP-2的Ki值分别为0.40 mg/mL和0.27 mg/mL，可见低分子质量多糖DP-2对α-淀粉酶抑制作用更明显，此结果和2.5节得到的结论一致。

图6 DP-1（A）和DP-2（B）对α-淀粉酶的抑制动力学Fig.6 Inhibition kinetics of DP-1 (A) and DP-2 (B) on α-amylase

3 讨 论

本实验采用超声波辅助Fe2+-VC-H2O2法制备的两种降多糖同本课题组先前报道的原黑加仑果实多糖相比[8]， 多糖链糖残基构成相同，但分子质量明显降低。此外，本课题组前期研究表明，原黑加仑果实多糖对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制的IC50分别为0.82 mg/mL和0.69 mg/mL[8]； 本研究中两种降解多糖对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的IC50均小于原黑加仑果实多糖。因此与原黑加仑果实多糖相比，降解多糖对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性显著增加。原因是多糖分子质量的降低使位于多糖内核中的活性基团暴露，形成多糖和酶的复合物，从而有效抑制酶活性[2,30]。Zhi Zijian等采用超声辅助Fe2+-H2O2降解高分子质量的肝素（酸性多糖）并探讨其降解机理及低分子质量肝素的抗凝血活性。结果表明，同单独超声或氧化降解相比，超声辅助氧化降解可以产生更多羟自由基，利于解聚高分子，是制备低分子质量肝素高效和简便的方法；此外该方法得到的低分子质量肝素主要结构未发生改变，但是抗凝血活性显著升高，副作用减小[11]。Li Junhui等采用超声辅助H2O2-VC 降解果胶多糖，结果表明此方法不仅加速了降解过程，提高了降解效率，且增强了果胶降解多糖抗肿瘤活性[9]。 由此可见采用超声波辅助氧化法可有效降低天然多糖分子质量，进而改善多糖的生物活性。

4 结 论

超声波辅助Fe2+-VC-H2O2法制备的两种降解多糖（DP-1和DP-2）属于酸性杂多糖，由阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸构成。DP-1和DP-2具有相同结构特征，含有6 种糖残基；且均具有一定的吸湿、保湿能力和热稳定性，具有作为添加剂应用于化妆品和食品行业的潜力。此外，这两种多糖对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均具有明显的抑制作用，且对α-淀粉酶为竞争型抑制。