ANGPTL2、CXCR3在胃癌中的表达水平与其预后的关系

徐绮华，胡斌，林秀强

(佛山市第一人民医院胃肠肿瘤内科，广东 佛山 528000)

胃癌是指胃黏膜上皮细胞癌变形成的消化系统恶性肿瘤疾病，目前临床治疗主要采取外科手术及放化疗等综合治疗，随着医学发展，胃癌治疗取得较好成果，但仍存在患者预后不良，影响生存质量[1-3]。因此及早评估患者预后，并采取相应措施具有重要临床价值。血管生成素样蛋白2(Angiopoietin-like protein 2，ANGPTL2)属于溢泪分泌性糖蛋白，是血管生成素样蛋白特殊表现形式，对肿瘤血管生成具有调节作用[4-5]。趋化因子(C-X-C 基元)受体3(Chemokine receptor 3，CXCR3)因其具有抗肿瘤或促肿瘤的双向作用，在肿瘤发生发展中扮演重要角色[6]。ANGPTL2、CXCR3均可能参与胃癌生长重要过程，但临床上对其关系研究较少，基于此，本研究就我院胃肠肿瘤内科收治的75例胃癌患者研究，旨在探讨ANGPTL2、CXCR3在胃癌中的表达水平与其预后的关系。

1 一般资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年1月至2016年3月我院胃肠肿瘤内科收治的75例胃癌患者作为研究对象。纳入标准：(1)患者经术后病理学检查为胃癌；(2)患者无抗癌治疗史；(3)患者均属于腺癌伴胃癌根治术治疗；(4)患者及家属知情并签署知情同意书。排除标准：(1)患者患有心、肝、肾等重要脏器严重损伤；(2)患者患有其它恶性肿瘤；(3)患者患有严重免疫功能、凝血功能障碍；(4)患者中途转出治疗。75例胃癌患者，男性52例，女性23例，年龄28～82岁，平均年龄(52.64±13.55)岁，肿瘤最大直径>3 cm 46例，肿瘤最大直径≤3 cm 29例；根据Lauren’s分类方法本研究纳入瘤中组织为弥散性；根据2010年国际抗癌联盟/美国癌症联合委员会TNM分期标准，Ⅰ+Ⅱ期21例，Ⅲ+Ⅳ期54例；淋巴结转移53例，无淋巴结转移22例。本研究提交我院医学伦理委员会审核并通过。

1.2 方法

所有患者均进行胃大部分切除、全胃切除加清除胃周第二站淋巴结等常规胃癌根治术治疗，术后根据病理分期进行辅助化疗。

1.2.1ANGPTL2表达水平检测采用免疫组化法检测，手术切除标本使用石蜡包埋，作4μm连续切片，脱蜡、水化、抗原修复后3min冲洗后滴加双氧水去氧化酶去活，滴加抗体于室温过夜，ANGPTL2试剂盒购自上海生物科技有限公司，严格按照试剂盒说明书操作，由该公司提供阳性切片作为阳性对照组；将DAB显色液滴加至载玻片，并于高倍显微镜下观察，显色达到要求后冲洗，使用苏木精复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，标记备用。评价标准：染色标准：ANGPTL2染色在人脐静脉内皮细胞，阳性表达呈黄色或棕黄色颗粒。随机选择3个高倍视野观察载玻片染色范围及程度，按照染色强度(无阳性着色、弱、中、强染色)，分别记为0、1、2、3分；阳性细胞率(0.0%、1.0%～25.0%、26.0～49.0%、50.0%～100.0%)分别记为0、1、2、3分，两项评分之和记为最终结果，阴性表示0～2分，阳性表示3～6分。

1.2.2CXCR3表达水平检测采用免疫组化法检测，脱蜡、水化、抗原修复后血清封闭，分别加入兔抗人CXCR3(表达于淋巴细胞)多克隆抗体(上海生物科技有限公司)和兔抗人CD34(表达于纤维细胞)单克隆抗体(北京中杉金桥公司)，于4℃过夜孵育，加入二抗孵育后同1.2.1显色、苏木精染复染、封片。严格按照试剂盒说明书操作。评估标准：CXCR3阳性染色为出现明显棕黄色颗粒。按照染色强度(无阳性着色、淡黄色、黄色、棕黄色)、阳性细胞率(0.0%、6.0%～25.0%、26.0～50.0%、51.0%～100.0%)，分别记为0、1、2、3分，两项评分之积记为最终结果，低表达≤1分，高表达≥2分。

微血管数(Microvessel density，MVD)计数方法：选取200倍下5个典型的视野；一个MVD计数为周围肿瘤成分区别明显的单个内皮细胞或内皮细胞簇(CD34阳性表达)，取平均值；然后计算所有样本MVD中位数，小于该数者为低MVD，大于该数者为高MVD。

1.3 观察指标

患者均常规行标准胃癌根治术治疗，即胃大部分或全胃切除加清除胃周第二站淋巴结，术后根据分期行辅助化疗。随访3年，每半年随访1次，随访率100.0%，观察胃癌组织中ANGPTL2表达水平及预后(复发、无病生存期及三年生存率)关系；CXCR3表达水平与胃癌临床病理特征(分化程度、浸润深度、TNM分期及淋巴结转移)关系。

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 胃癌组织及癌旁组织中ANGPTL2表达水平比较

胃癌组织ANGPTL2阳性表达率明显高于癌旁组织，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 胃癌组织及癌旁组织中ANGPTL2表达水平比较[n(%)]

2.2 患者预后情况分析

随访3年，75例患者中有34例患者复发，29例死亡；无复发33例，存活46例；复发率45.3%(34/75)、3年生存率61.3%(46/75)，无病生存期4～36个月，平均无病生存期(16.68±4.81)个月，见图1。

1.00.50.0061218243036生存率/%时间(月)

2.3 不同ANGPTL2表达与患者预后比较

ANGPTL2阳性组复发率高于ANGPTL2阴性组，无病生存期短于ANGPTL2阴性组，3年生存率明显低于ANGPTL2阴性组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 不同ANGPTL2表达与患者预后比较

2.4 胃癌组织中ANGPTL2表达对预后Logistic线性回归分析

将上述具有统计意义纳入Logistic线性回归分析显示，ANGPTL2阳性表达是复发率、无病生存期、3年生存率独立危险因素(P<0.05)，见表3。

表3 胃癌组织中ANGPTL2表达对预后Logistic线性回归分析

2.5 CXCR3表达与胃癌临床病理特征关系

CXCR3高表达组分化程度、浸润深度、TNM分期及淋巴结转移与CXCR3低表达组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 CXCR3表达与胃癌临床病理特征关系

2.6 MVD与胃癌临床病理特征的关系

胃癌分化程度低患者MVD值高于分化程度高患者，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表5。

表5 MVD与胃癌临床病理特征的关系

2.7 胃癌组织中CXCR3表达与MVD的相关性

胃癌组织中CXCR3高表达患者MVD值低于低表达患者MVD值(P<0.05)；胃癌组织中CXCR3表达与MVD呈负相关(P<0.05)，见表6。

表6 胃癌组织中CXCR3表达与MVD的相关性

2.8 生存分析

患者生存时间4～36个月，中位生存22个月，Kaplan-Meier分析发现，胃癌组织中CXCR3高表达患者生存时间长于CXCR3低表达患者，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图2。

1.00.50.0061218243036生存率/%时间(月)高表达低表达

3 讨 论

近年来，随着生活结构变化，消化道恶性肿瘤疾病发病率出现大幅度增加，其中胃癌发生率位居榜首，病死率较高，严重威胁患者生命健康[7-8]。随着医疗结构不断升级，胃癌诊断治疗具有较大突破，临床治疗首选外科手术，能够切除病灶，极大改善患者临床症状，但部分患者预后效果无法满足其临床需求，因此需要提高患者预后情况[9-10]。胃癌发生发展同其他恶性肿瘤类似，均被多种基因调控，因此，选择科学有效方法对患者预后及时评估并采取相应措施具有重要意义。

有研究报道，ANGPTL2高表达可加速生成肿瘤血管及上皮、间充质转换，进而完成肿瘤转移，造成肿瘤患者预后不良[11-12]。有研究表示，患皮肤鳞癌ANGPTL2转基因小鼠间充质标志N-cadherin、Slug及Snail mRAN表达上升，上皮标志E-cadherin mRAN表达降低，但ANGPTL2基因敲除小鼠结果与之相反。证实了ANGPTL2上皮、间充质转换。据此，可说明ANGPTL2与胃癌存在一定相关性，明确胃癌组织中ANGPTL2表达水平对患者预后评估并采取相应措施具有重要意义[13-14]。本研究结果中，纳入病例存在部分年轻患者，可以说明胃癌逐渐呈现年轻化，且在诊断时发现部分患者肿瘤分期晚，发生淋巴结转移，一定程度上阻碍了治疗，需要改进治疗方案。同时胃癌组织ANGPTL2阳性表达率明显高于癌旁组织，证实了胃癌组织中ANGPTL2阳性表达率与胃癌发生发展有关。随访3年发现，75例患者复发率45.3%、3年生存率61.3%，平均无病生存期较短，提示患者预后较差，应立即改善。另外，与ANGPTL2阴性患者比较，ANGPTL2阳性患者复发率高、无病生存期短、3年生存率低。说明ANGPTL2表达与胃癌患者预后密切相关。进一步Logistic线性回归分析得出，ANGPTL2阳性表达是复发率、无病生存期、3年生存率独立危险因素，提示检测胃癌组织中 ANGPTL2 表达情况有利于早期评估预后。ANGPTL2能加速生成肿瘤血管，进而发生转移，影响预后。

趋化因子受体作为细胞表面蛋白，能够与趋化因子配体结合趋化诱导细胞，属于7次跨膜G蛋白偶联受体，在肿瘤细胞表面表达，具有双向作用，可直接影响肿瘤细胞转换、生长、侵袭和转移[15-16]。按照氨基末端附近半胱氨酸残基位置可将趋化因子分为4类，大部分趋化因子为CXC 和CC 家族，其中趋化因子CXC家族按照第一保守半胱氨酸残基前谷氨酸-亮氨酸-精氨酸结构存在情况，分为ELR+ CXC、ELR-CXC，ELR-趋化因子以阻碍内皮细胞迁移增殖行抗肿瘤作用为原则[17-18]。CXCR3作为ELR-趋化因子主要受体，可表达于多种肿瘤细胞，获得多种结果。本研究采用CD34进行标记微血管计数，主要是由于CD34为血管标志物，具有较高敏感性，在正常组织及肿瘤组织中稳定表达[19-20]。结果表示，与CXCR3低表达组比较，CXCR3高表达组分化程度较高、浸润深度较浅、TNM分期较低、无淋巴结转移；胃癌分化程度低患者MVD值高于分化程度高患者，且胃癌组织中CXCR3表达与MVD呈负相关(P<0.05)说明CXCR3表达在胃癌侵袭、转移中具有重要意义，CXCR3高表达MVD值偏低。经Kaplan-Meier分析得出，胃癌组织中CXCR3高表达患者生存时间长于CXCR3低表达患者，提示CXCR3高表达预示患者预后较好，延长患者生存时间。

综上所述，胃癌组织中ANGPTL2、CXCR3表达均与患者预后相关，其中ANGPTL2阳性表达较高，影响胃癌复发、无病生存期及三年生存率，可作为评估预后不良观察指标；CXCR3在分化程度高、浸润程度浅、TNM分期低及及无淋巴结转移的胃癌患者中呈高表达，与胃癌浸润、转移相关。