华蟾素对二乙基亚硝胺致大鼠原发性肝癌抑制作用及抗氧化活力的影响

安旭，董禹钊，杨加周

(延安大学医学院组织与胚胎学教研室，陕西汉中 716000)

据统计，肝癌为我国常见恶性肿瘤以及主要肿瘤死因[1]。根治性手术为肝癌主要且最有效治疗手段，但由于起病隐匿，大多患者确诊时已处于中晚期，手术疗效欠佳[2]。放疗和化疗虽可一定程度上减少肿瘤细胞，控制疾病进展，但部分患者对放化疗敏感性较低，且可出现耐药性[3]。既往研究发现，二乙基亚硝胺(Diethylnitrosamine，DEN)可致原发性肝癌大鼠血清抗氧化活性降低，从而使活性氧产物增多，促进肿瘤发生和发展[4]。随着医疗技术发展，临床逐渐形成了中西医结合的抗肿瘤治疗策略，并取得客观效果。华蟾素是由中华大蟾蜍干燥表皮及其腺体分泌物水溶液制成，具有清热解毒、消肿止痛效。现代药理学证实，华蟾素具有提高免疫力、抗肿瘤等作用[5]，但其是否具有抗氧化及其对DEN致大鼠原发性肝癌抑制作用尚未完全阐明[6-7]。鉴于此，本研究进行了相关分析，旨在为临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

SD大鼠：SPF级，75只，雌雄各半，平均体质量为(162.42±10.54)g，6～9周，购自广东省医学实验动物中心，实验动物许可证号SCXK(粤)2018-0002。适应性饲养1周后，随机分为空白对照组、模型组、华蟾素低剂量组、华蟾素中剂量组、华蟾素高剂量组，每组各15只。动物伦理审查批准号(2020469)。

1.2 主要试剂与仪器

二乙基亚硝胺(货号N0258-1G)：美国Sigma公司，避光保存。华蟾素注射液(国药准字号Z34020273，规格5mL*10支，批号151224.2)：安徽金蟾生化股份有限公司。大鼠丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒(货号HZ-0729)、大鼠天冬氨酸氨基转移酶检测试剂盒(货号HZ-0748)、大鼠总胆红素检测试剂盒(货号HZ-47430)：上海沪震实业有限公司。大鼠超氧化物歧化酶检测试剂盒(货号DRE20008)：上海邦奕生物科技有限公司。大鼠谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒(货号SBJ-R0785)：南京森贝伽生物科技有限公司。大鼠过氧化氢酶检测试剂盒(货号XY-A13557)：上海信裕生物科技有限公司。大鼠丙二醛检测试剂盒(货号YS03295B)：上海雅吉生物科技有限公司。酶标仪(型号Multiskan FC)：美国赛默飞世尔公司。

1.3 模型构建[8]

采用DEN制备大鼠原发性肝癌模型。以大豆油配制四氯化碳溶液，经模型组、华蟾素低剂量组、华蟾素中剂量组、华蟾素高剂量组大鼠后肢皮下注射，3 mL/kg，2次/周，连续4周；第5周将饮用水更换为DEN溶液(95 μg/mL)，自由饮用，每日更换，连续20周。空白对照组大鼠以等量大豆油皮下注射后，给予普通饮用水。华蟾素低剂量组、华蟾素中剂量组、华蟾素高剂量组大鼠在饮用DEN溶液时，同时分别给予华蟾素1 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg，腹腔注射，1次/日，连续20周。空白对照组和模型组大鼠以等体积生理盐水，腹腔注射，1次/日，连续20周。

1.4 观察指标

1.4.1癌变率、肝脏指数及肝表面癌结节数 末次给药24 h，腹腔麻醉后，称取体质量，处死大鼠，取肝脏组织；称取肝脏组织重量后，计数癌变只数、肝表面癌结节数，癌变率(%)=癌变只数/总只数×100%，肝脏指数(%)=肝脏组织重量(g)/体质量(g)×100%。

1.4.2瘤重及抑瘤率 末次给药24 h，腹腔麻醉后，称取体质量；处死大鼠，剥离模型组、华蟾素低剂量组、华蟾素中剂量组、华蟾素高剂量组肿瘤块，称取瘤重；抑瘤率(%)=(模型组瘤重-华蟾素干预组瘤重)/模型组瘤重×100%。

1.4.3血清肝功能指标水平 末次给药24 h，腹腔麻醉大鼠，经腹主动脉取血，低温3 000 r/min离心2 min，取血清；采用酶联免疫吸附法，酶标仪测定血清丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase，AST)、总胆红素(Total bilirubin，TBIL)水平。

1.4.4血清抗氧化活力指标水平 取血清，采用酶联免疫吸附法，酶标仪测定血清超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)水平。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠癌变率、肝脏指数及肝表面癌结节数比较

与空白对照组比较，模型组大鼠癌变率、肝脏指数和肝表面癌结节数显著增加(P<0.05)；与模型组比较，华蟾素处理大鼠癌变率、肝脏指数和肝表面癌结节数显著降低，且具有剂量依赖性(P<0.05)。表1，图1。

表1 各组大鼠癌变率、肝脏指数及肝表面癌结节数比较

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2.2 各组大鼠瘤重和抑瘤率比较

与模型组比较，华蟾素处理大鼠瘤重显著降低，且具有剂量依赖性(P<0.05)；抑瘤率随华蟾素剂量增加而增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。表2。

表2 各组大鼠瘤重和抑瘤率比较

2.3 各组大鼠血清肝功能指标水平比较

与空白对照组比较，模型组大鼠血清ALT、AST和TBIL水平显著升高(P<0.05)；与模型组比较，华蟾素处理大鼠血清ALT、AST和TBIL水平显著降低，且具有剂量依赖性(P<0.05)。表3

表3 各组大鼠血清肝功能指标水平比较

2.4 各组大鼠血清抗氧化活力指标水平比较

与空白对照组比较，模型组大鼠血清SOD、GSH-Px和CAT活性显著降低，MDA活性显著升高(P<0.05)；与模型组比较，华蟾素处理大鼠血清SOD、GSH-Px和CAT活性显著升高，MDA活性显著降低，且具有剂量依赖性(P<0.05)。表4

表4 各组大鼠血清抗氧化活力指标水平比较

3 讨 论

基于中国肿瘤登记年报等多个国内外数据源，发现总体上，我国肝癌发病率和死亡率仍处于较高水平，人群疾病负担重[9]。根治性手术可明显改善肝癌患者预后，但术后5年生存率仅约50%[10]，且术后5年复发率达60%～70%[11]。放化疗为除手术治疗外，肝癌重要辅助治疗手段[12]。但研究发现，肝癌患者对放化疗敏感性不高，应用受到限制[13]。临床实践发现，中药在恶性肿瘤治疗中发挥重要作用。中医学中，肝癌属“肝积”、“黄疸”、“血证”等范畴，其中肝郁气滞为该病基本病机[14]。《神农本草经》中记载，“蟾蜍味辛寒，主邪气，破癌坚血、痈肿、阴疮，服之不患热病”。表明蟾蜍在治疗恶性肿瘤上具有重要价值。华蟾素为干蟾皮提取物，其活性成分主要以华蟾素精、蟾毒它灵等蟾毒内酯类物质为主，具有清热解毒、消肿止痛、祛瘀散结功效。近年研究发现，华蟾素在抗肿瘤方面亦具有重要作用[15]。

高波等[16]研究发现，无论体外还是体内，华蟾素均具有明显的抑瘤作用。王培培等[17]研究发现，华蟾素对H22肝癌小鼠有显著抑瘤作用，并可显著增强小鼠免疫力，增强顺铂化疗效果。本研究亦得出，华蟾素对DEN致原发性肝癌大鼠有显著的抑瘤作用，其强度具有剂量依赖性，符合以往研究结果。同时通过检测小鼠肝功能指标发现，华蟾素对DEN致原发性肝癌大鼠肝功能具有明显改善作用，可能与其提高机体及细胞免疫功能有关[18]。ROS增多可导致机体内氧化与抗氧化失衡，参与多种恶性肿瘤发病[19]。研究表明，通过降低细胞内氧化活性，可有效抑制肿瘤细胞增殖和迁移[20]。本研究结果显示，华蟾素可显著降低DEN致原发性肝癌大鼠血清MDA活性，提高SOD、GSH-Px和CAT活性，其强度具有剂量依赖性，表明华蟾素可能通过提高DEN致原发性肝癌大鼠肝组织抗氧化活力，发挥抗肿瘤作用。

综上所述，华蟾素可能通过提高DEN致原发性肝癌大鼠肝组织抗氧化活力，发挥抗肿瘤作用。