石仙桃多糖对肺炎支原体感染模型小鼠肺泡灌洗液中趋化因子表达的影响

杜辉朝 黄梅青 赵世元

[摘要] 目的 探討石仙桃多糖（PCLP）对肺炎支原体肺炎模型小鼠肺泡灌洗液（BALF）中趋化因子的影响。 方法 90只BABL/C裸鼠，采用随机抽签法分为模型组、克拉霉素组和PCLP组，每组30只。用类胸膜肺炎生物肉汤培养基培养肺炎支原体，将成功培养的肺炎支原体滴入裸鼠鼻腔1×107 CCU/mL菌液各50 μL，共8 d，在最后一次接种后第2天开始用PCLP干预。在干预1、3 d和6 d后，分别收集小鼠BALF，用SP4琼脂平板定量培养BALF肺炎支原体，肺部组织用中性甲醛固定HE染色，观察肺炎支原体感染小鼠肺的病变程度，用酶联免疫吸附试验测定小鼠BALF中趋化因子单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、巨噬细胞炎性蛋白-1α（MIP-1α）、γ-干扰素诱导性单核因子趋化因子（MIG）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、干扰素诱导蛋白10（IP-10）以及角质细胞诱导因子（KC）等趋化因子的水平。 结果 与模型组比较，石仙桃多糖组BALF定量培养肺炎支原体菌落数量有减少趋势，但差异无统计学意义（P > 0.05），PCLP组肺部炎症明显好转，肺组织病理评分和肺实质炎症评分下降（P < 0.05），石仙桃多糖干预肺炎支原体肺炎小鼠3 d后，小鼠BALF中细胞因子MIP-1α、MIG以及IP-10的表达明显下调，差异均有统计学意义（P < 0.05）。 结论 PCLP显著减轻肺炎支原体小鼠肺部炎症，其机制可能与降低肺炎支原体模型小鼠体内MIP-1α、MIG和IP-10等趋化因子的表达有关。

[关键词] 石仙桃多糖；肺炎支原体；趋化因子

[中图分类号] R730.53 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）02（a）-0008-04

Effects of Pholidota chinensis Lindl Polysaccharides on the levels of chemokines of bronchoalveolar lavage fluid in a murine model of Mycoplasma pneumoniae pneumonia

DU Huichao1 HUANG Meiqing2 ZHAO Shiyuan3

1.Department of Pharmacy， Chongzuo People's Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Chongzuo 532200， China； 2.Department of Paediatrics， Chongzuo People's Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Chongzuo 532200， China； 3.Affiliated National Medical Center Laboratory of Guangxi Medical University， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530001， China

[Abstract] Objective To investigate the Pholidota chinensis Lindl Polysaccharides （PCLP） on mice model of Mycoplasma pneumoniae pneumonia in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） effect of chemokine. Methods Ninety BABL/C nude mice were randomized into model group， clarithromycin group and polysaccharide group， 30 rats in each group. Medium of Mycoplasma pneumoniae with PPLO broth， the successful isolation of Mycoplasma pneumoniae drops into the nasal cavity in 1×107 CCU/mL 50 μL， 8 d， on the second day after inoculation to 1 last polysaccharide with Pholidota intervention. After intervention of 1， 3 d and 6 d， respectively， bronchoalveolar lavage fluid （BALF） were collected， Mycoplasma pneumoniae of BALF was cutured by SP4 agar plate quantitative recovery of lung tissue， by formalin fixation and HE staining， the lesions of mouse lung of Mycoplasma pneumoniae infection in BALF mice were observed， Macrophage inflammatory protein-1α （MIP-1α）， MIG， KC， Macrophage inflammatory protein-1 （MCP-1） and interferon-γ-inducible protein 10 （IP-10） chemotaxis cytokine levels were measured by ELISA. Results BAL Mycoplasma pneumoniae pneumonia concentrations in mice treated with PCLP tended to be reduced compared with mice treated with placebo （MpPl）， however there was no statistically significant difference （P > 0.05）； the lung HPS was significantly lower， as well as the parenchymal-pneumonia subscore. 3 d after Polysaccharide intervention in Mycoplasma pneumoniae pneumonia mice， the expression of chemokines MIP-1α， MIG and IP-10 in BALF mice were significantly reduced， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Polysaccharide significantly reduce the Mycoplasma pneumoniae lung inflammation in mice， the mechanism may be related to the inhibition of MIP-1α， MIG and IP-10 chemokines in vivo in mice model of Mycoplasma pneumoniae.

[Key words] Pholidota chinensis Lindl Polysaccharides； Mycoplasma pneumoniae； Chemokines

石仙桃来源于兰科石仙桃属植物石仙桃Pholidota chinensis Lindl.的假鳞茎或全草，广泛分布于福建、广东、广西等。其水提物具有养阴、清肺、利湿、消瘀的功效，民间用来治疗眩晕、头痛、咳嗽、吐血、梦遗、痢疾等[1]。石仙桃主要成分是多糖[2]，其药理作用研究较少。本课题组采用石仙桃提取的石仙桃多糖（Pholidota chinensis Lindl Polysaccharides，PCLP），通过建立肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae，MP）肺炎模型BALB/c小鼠，通过定量培养肺泡灌洗液（broncho？鄄alveolar lavage fluid，BALF）肺炎支原体、肺组织病理学评分（histopathological score，HPS）和检测BALF中趋化因子单核细胞趋化蛋白-1（Monnocyte chemoattr？鄄actant protin-1，MCP-1）、巨噬细胞炎性蛋白-1α（Mac？鄄rophage inflammatory protein-1ɑ，MIP-1ɑ）、γ-干扰素诱导性单核因子趋化因子（MIG）、单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein，MCP-1）、干擾素诱导蛋白10（interferon-γ-inducible protein 10，IP-10）以及角质细胞诱导因子（keratinocyte chemoattractant，KC）等趋化因子的表达，探讨石仙桃多糖治疗肺炎支原体肺炎小鼠的可能作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验用药

PCLP的提取[2]，石仙桃鳞径采自广西柳州柳江区境内，经广西中医学院药用植物教研室刘寿养教授鉴定为兰科石仙桃属植物石仙桃Pholidota chinensis Lindl.，石仙桃鳞径洗净后切细，干燥后打粉。石仙桃粉加1︰40水80℃回流5 h，待冷却后用无水乙醇沉淀，沉淀物用丙酮和乙醚萃取数次，得粗多糖。粗多糖用Sevag法脱除蛋白质，用95%乙醇沉淀，再将沉淀物水解、醇沉，用丙酮和乙醚脱水，重复操作数次，得石仙桃多糖。经高效色谱，有一对称单峰，并在260～280 nm无吸收峰，说明多糖含量较高。样品保存在广西民族医院中心实验室。

1.1.2 主要仪器和试剂

UV紫外可见分光光度计，美国安捷伦公司；IR EQUINOX 55红外光谱仪，德国Bruker公司；超导核磁共振谱仪英国VG公司；熔点测定仪，北京科仪电光仪器厂。柱层析用硅胶（100～200目），青岛海洋化工厂生产，批号：14089；薄层层析硅胶（200～300目），青岛海洋化工厂生产，批号：141020。

1.1.3 实验动物

BALB/c小鼠，SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物动物合格证编号：SCXK（京）2016-009。BALB/c小鼠5周龄，（20±2）g，雌雄各半，小鼠在广西中医药大学动物实验中心饲养，BALB/c小鼠饲养条件：室温20～25℃，用干燥锯末垫底，室内通风良好，光线良好充足。

1.1.4 其他试剂

PPLO肉汤培养基购于青岛海博生物技术有限公司，肺炎支原体菌液购于上海宝米科生物科技有限公司。克拉霉素缓释片：161201，江西制药有限责任公司生产。MIP-1α（批号：20160905）、MIG（批号：20161005）、KC（批号：20160506）、MCP-1（批号：20160803）以及IP-10（批号：20160801）等趋化因子购于BioSource International，Camarillo，CA.公司。

1.1.4 仪器

酶标仪，上海科华生产，型号：MK3。

1.2 实验方法

1.2.1 肺炎支原体的培养

肺炎支原体在每瓶20 mL的SP4肉汤内于37℃、5%CO2培养72 h后，肉汤变成橙色，倒出上清液，加新鲜的SP4肉汤2 mL到烧瓶，收集贴壁存活肺炎支原体。将肺炎支原体配成108～109 CFU/mL，加制霉菌素（50 U/mL）和氨苄青霉素（1 mg/mL），样本保存在-80℃备用。

1.2.2 动物模型的建立

实验方案由广西医科大学实验动物伦理委员会审查，所有的动物按照实验动物的护理和使用指南处理。新购BALB/c小鼠适应新环境3 d。90只BALB/c小鼠随机抽签为模型组、克拉霉素组和石仙桃多糖组，每组30只。各组小鼠第0天接种含1×107 CCU/mL肺炎支原体菌液各50 μL；第5、8和9天接种含1×107 CCU/mL肺炎支原体菌液各100 μL。石仙桃多糖组小鼠于第9 d起首次皮下注射石仙桃多糖20 mg/kg，以后每天按10 mg/kg连续6 d皮下注射；克拉霉素组小鼠于第9天起首次皮下注射克拉霉素10 mg/kg，以后每天按5 mg/kg连续6 d皮下注射；模型组在相同时间注射等体积的生理盐水。用药期间每天观察各组小鼠表现，如小鼠存活、进食、饮水、活动度、精神状态差，有无竖毛寒战、咳嗽、口鼻分泌物有无增多。在用药1、3 d和6 d后，各组分别取10只小鼠，用乙酰丙嗪氯胺酮按5 mg/kg腹腔注射麻醉小鼠后用25号针头将500 μL SP4肉汤注入肺部，随后又将该液抽吸到注射器，BALF分3管，第1管做肺炎支原体培养，第2管做细胞计数，第3管离心吸上清并储存在-80℃；肺标本用10%福尔马林溶液固定进行组织学评价。

1.2.3 指标检测

1.2.3.1 BAL肺炎支原体培养 将BAL用SP4肉汤10倍稀释，接种在SP4琼脂平板，置37℃培养48 h。通过计数琼脂板上菌落数量推算BAL标本细菌数量（用log10 CFU/mL表示）。

1.2.3.2 肺组织病理学评分（HPS）和肺实质评分 肺组织经10%甲醛固定，石蜡包埋切片，经苏木精-伊红染色。肺组织HPS由专业病理医师双盲镜检。HPS分级基于细支气管支气管浸润数目、细支气管支气管管腔渗出程度、血管周围浸润百分率和实质性肺炎严重程度（中性粒细胞肺泡浸润）；该HPS系统分值0～26分，分数越高代表肺组织炎性浸润程度越高。实质性肺炎的得分是基于分级的中性粒细胞肺泡浸润（评分：0分，没有实质性肺炎；3分，片状实质性肺炎；5分，片状融合实质性肺炎）。

1.2.3.3 各组小鼠BALF中细胞因子的检测 采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法测定BALF中MIP-1α、MIG、KC、MCP-1以及IP-10等粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的水平，操作步骤严格按照ELISA试剂盒说明书进行。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用LSD-t检验，多组间比较采用单因素方差分析；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验动物的一般情况

BALB/c小鼠感染肺炎支原体第1天，多数小鼠出现疲倦、竖毛，造模第3天，小鼠出现咳嗽、食欲不振、体重减轻，有少数小鼠转圈现象，小鼠肺组织出现充血，BALF呈红色浑浊。说明造模成功。

2.2 各组小鼠BALF肺炎支原体培养

石仙桃多糖组治疗肺炎支原体小鼠3、6、9 d后，各组小鼠BALF定量培养肺炎支原体，结果显示，与模型组比较，用克拉霉素治疗肺炎支原体小鼠1、3、6 d后，小鼠BALF肺炎支原体有减少的趋势，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图1。

2.3 各组肺组织HE染色和肺组织病理评分

石仙桃多糖组治疗肺炎支原体肺炎小鼠3 d后，小鼠肺组织HPS评分和实质性肺炎评分明显降低，与模型组比较差异有统计学意义（P = 0.035、0.004）；尤其是治疗3 d后小鼠肺组织HPS评分和实质性肺炎评分降低非常明显（P = 0.002、0.025），见图2～3。HE染色可见，模型组小鼠肺组织出现重度炎症改变：肺泡出现大量的渗出物，肺泡间质增宽，在支气管和血管周围和肺泡间质有大量淋巴细胞和巨噬细胞浸润；克拉霉素组治疗肺炎支原體模型组6 d后炎症细胞明显减少；石仙桃多糖治疗组小鼠6 d后肺组织出现中度也明显减少：可见肺泡间质稍增宽，在支气管、血管周围有少量淋巴细胞和巨噬细胞，见图4。

2.4 石仙桃多糖干预肺炎支原体肺炎小鼠1、3、6 d对BALF中各趋化因子表达的影响

石仙桃多糖组干预肺炎支原体肺炎小鼠1 d，小鼠BALF中KC和MCP-1的表达有所下调，但与模型组比较差异无统计学意义（P > 0.05）；小鼠BALF中MIG、IP-10等趋化因子的表达迅速下调，与模型组比较差异有统计学意义（P < 0.05），见表1。用石仙桃多糖干预肺炎支原体肺炎小鼠3 d后，小鼠BALF中MIP-1α、MIG、KC、MCP-1以及IP-10等趋化因子的表达下调，与模型组比较差异有统计学意义（P < 0.05），见表2。石仙桃多糖组干预肺炎支原体肺炎小鼠6 d后，小鼠BALF中MIG表达下调非常明显，与模型组比较差异有统计学意义（P < 0.05）；小鼠BALF中MIP-1α、KC和MCP-1等趋化因子表达差异无统计学意义（P > 0.05），见表3。

3 讨论

肺炎支原体是一种“非典型”细菌，缺乏细胞壁，在儿童和成人急性下呼吸道感染中起着重要的作用，在一般人群有20%～30%因肺炎支原体致社区获得性肺炎[5]。在过去的几十年里，肺炎支原体感染引起反应性气道疾病和哮喘得到越来越多的关注[6-9]。临床研究表明，大环内酯类药物或四环素治疗肺炎支原体肺炎，减少肺炎的发病率，缩短病程，降低哮喘复发率，是治疗肺炎支原体肺炎的首选[10]。然而，尽管用大环内酯类、酮内酯类以及肽脱甲酰基酶抑制剂药物治疗动物肺炎支原体肺炎能显著改善调查肺部炎症，但肺炎支原体在体内无法根除，加上治疗时间长，治疗中易产生呕吐、腹泻、纳差等消化道症状。

石仙桃属（Pholidota）是兰科（orehidaeeae）植物，别名石橄榄、石上仙桃和石上莲等。石仙桃性甘、淡、凉，具有清热润燥、化疾止咳、滋阴解毒、凉血止痛等功效，民间用于肺热咳嗽、肺结核咳血、淋巴结结核、小儿舟积、胃十二指肠溃疡、外用治疗慢性骨髓炎等。用石仙桃的鲜品或干品煎汤内服，可治肺结核咯血、慢性咳嗽、胃肠炎、慢性胃炎、小便不利、湿热浮肿、咽喉肿痛[11-12]。石仙桃的主要成分是多糖，含量高达2.25%[13]。研究表明，多糖具有多方面的生物活性，如抗病毒、抗炎、抗肿瘤、抗凝血、降糖等作用[14]。但迄今为止，有关石仙桃多糖抗肺炎支原体肺炎未见报道。

本次实验，定量肺炎支原体滴鼻BALB/c小鼠，小鼠感染肺炎支原体1～3 d，大多数小鼠进食减少，出现明显疲劳，部分有竖毛现象；造模第3天，大部分小鼠出现咳嗽，体重下降；造模第6天，个别小鼠出现转圈，解剖小鼠肺部，发现肺组织出血，病理评分较高，肺组织有较为严重的炎性反应，说明造模成功。用石仙桃多糖干预小鼠3 d后，小鼠活动增加，咳嗽减少，毛发变光亮，体重增加；石仙桃多糖干预肺炎支原体小鼠后，其BALF肺炎支原体培养菌落明显比模型组减少，肺组织病理评分较低，肺组织炎性反应减少。

本实验中采用石仙桃多糖干预肺炎支原体模型BALB/c小鼠1、3、6 d，定量培养小鼠BALF肺炎支原体，结果发现，用药干预后的肺炎支原体有减少的趋势，但与模型组比较差异无统计学意义（P > 0.05），石仙桃多糖治疗肺炎支原体肺炎定量微生物培养结果与其改善肺部炎症不相关，其机制未明。

肺炎支原体感染机体后通过直接或间接损伤导致胸膜炎，引起渗出增加、免疫炎性反应增强以及受损细胞释放各种酶、补体、生物活性物质增加、导致胸膜毛细血管通透性增高。

研究发现机体感染后趋化因子或趋化因子受体的上调或下调可以影响疾病的易感性和严重性。趋化因子根据氨基端半胱氨酸的排列方式不同，分为C、CC、CXC和CX3C亚家族，它们通过与7次跨膜的、G蛋白偶联的趋化因子受体相结合而发挥生物效应[15-17]，IP-10和MIG介导白细胞向移植物募集，IP-10是表达于Th1细胞的趋化因子受体的功能激动剂，在淋巴细胞的免疫活化、炎症浸润、细胞迁移和发生效应中发挥重要作用[18]。趋化因子MIG是CXC趋化家族的成员，主要趋化白细胞，参与机体炎性反应，同时MIG亦能影响巨噬细胞、内皮细胞和肥大细胞活性，在调节局部炎性反应中起重要作用，具有广泛的生物学活性，可能参与肿瘤血管形成、促进细胞有丝分裂和调节宿主免疫功能等作用[19]。MCP-1、MIP-1α均属于趋化因子亚组，通过与蛋白偶联的跨膜受体传导信号，激活下游信号转导通路，发挥趋化、吞噬以及调节炎症因子合成的生物学功能，能引起各种急慢性炎症，在许多炎症性疾病的发病中起重要作用[20]。本实验中我们用石仙桃多糖干预肺炎支原体模型BALB/c小鼠1 d，MIG、IP-10等趋化因子表达首先下调，干预肺炎支原体模型BALB/c小鼠3 d，小鼠BALF中MIP-1α、MIG、MCP-1以及IP-10等趋化因子表达下降明显，干预6 d，小鼠BALF中MIG表达下调。石仙桃多糖干预肺炎支原体模型BALB/c小鼠1～6 d，小鼠BALF中MIG的表达一直保持下调。可能的原因是石仙桃多糖趋化白细胞、巨噬细胞、内皮细胞和肥大细胞活性，减轻肺炎支原体小鼠肺部炎症。

综上所述，石仙桃多糖显著减轻肺炎支原体小鼠肺部炎症，改善肺炎支原体模型小鼠呼吸道症状。其机制可能是与石仙桃多糖降低肺炎支原体模型小鼠体内MIP-1α、MIG、MCP-1以及IP-10的趋化因子的表达有关。本研究为开发石仙桃多糖作为抗肺炎支原体肺炎新药和临床应用奠定一定的试验基础和提供理论依据。

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（收稿日期：2017-08-24 本文编辑：任 念）