Nrf2缺乏加剧小鼠脑出血模型的抑郁及认知障碍
2021-08-19杨洁傅君毅谢富华刘天妮杨华才
杨洁,傅君毅,谢富华,刘天妮,杨华才
(1.广州医科大学附属第二医院神经内科,广东 广州 510260;2.广州医科大学附属第二医院重症医学科,广东 广州 510260)
脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是临床上的危急重症之一,发病占脑卒中的 10%~30%,具有高发病率、高死亡率和低治愈率的特点[1]。血肿压迫病灶周围脑组织,导致神经细胞受损,诱发脑部炎症变化,激活神经细胞凋亡,并最终引起继发性脑组织损伤,而这些继发性脑组织损伤能导致脑出血后的抑郁和认知功能损伤。有证据表明,约15%~20%的脑出血幸存者存在明显的抑郁症状[2-3],且脑出血较脑梗死更容易出现认知功能损害[4]。而脑卒中后抑郁及认知功能障碍的发生会增加卒中复发的风险,使患者残疾率、死亡率增高[3],导致患者回归社会困难[5]。近期的研究显示,氧化应激及炎症反应导致抑郁发病[6]及卒中后认知功能障碍[7]。而核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid derived 2,Nrf2)为氧化应激与炎症反应的关键调控因子之一,可通过与抗氧化反应原件(antioxidant response element,ARE)的结合对机体主要的抗氧化酶表达发挥调控作用,抑制氧化应激,同时也抑制炎症反应导致的多种细胞损伤及神经递质释放,近期的多个研究显示Nrf2参与的抗氧化通路是脑出血后神经保护治疗的重要作用靶点[8],同时还是潜在的抗抑郁、抗认知障碍的选择[9-10]。
基于目前研究,已明确Nrf2分别在脑出血后神经保护、单纯抗抑郁及单纯抗认知障碍中均有保护作用,但Nrf2 在脑出血后抑郁及认知障碍的作用机制仍有待探索。因此,本研究拟通过建立胶原酶诱导的雄性C57BL小鼠脑出血模型,观察对比野生型(wild type,WT)及Nrf2-/-小鼠的抑郁情绪及认知功能,探讨Nrf2抑制脑出血后抑郁与认知障碍发生的机制。
1 材料与方法
1.1 小鼠分组
SPF级健康雄性 C57BL鼠 24 只,8周龄,体重 22~24g,由广东省医学实验小鼠有限公司提供。SPF级健康 C57BL背景的Nrf2-/-小鼠 24 只,8周龄,体重 22~24g,由Jackson lab(美国)公司提供。每种小鼠随机分为以下 4 组:假手术组(2组,WT假手术组与Nrf2-/-假手术组)及模型组(2组,WT模型组与Nrf2-/-模型组),分别进行情绪及认知行为评价。
所有实验所用Nrf2-/-小鼠均进行了基因型鉴定,采用小鼠尾部基因组DNA提取,PCR 反应及琼脂糖凝胶电泳法进行基因型鉴定。引物设计参照Jackson Lab公司protocol(https:∥www.jax.org/Protocol?stockNumber=017009 &protocol ID=26266),由深圳华大基因公司合成。
1.2 建立胶原酶诱发的ICH模型
采用Ⅶ-S型胶原酶注射法建立小鼠脑出血模型。根据先前描述的方法,通过向小鼠左纹状体中注射胶原酶诱导ICH。10% 水合氯醛腹腔内注射麻醉后,将小鼠置于立体定向框架中,在颅骨上钻一个小孔,用微量输注泵以恒定速度0.1μL/min将Ⅶ-S型胶原酶(0.075 U溶于0.5 μL生理盐水;美国Sigma,St Louis)注入左侧纹状体。以侵入纹状体中部而不损害运动皮层,部位如下:前部0.4 mm,距前囟外侧2.0 mm,在颅骨下方3.0 mm。假手术小鼠步骤同上,但仅输注等量的生理盐水。手术期间体温维持在(37±0.5)℃。手术后,将小鼠放回原笼中。按预实验结果[11],Nrf2-/-小鼠建模时,将VII-S型胶原酶进行调整(0.05 U溶于0.5 μL生理盐水; 美国Sigma,St Louis),可取得与WT小鼠相同血肿体积。ICH手术后每天监测小鼠的生命状况。
1.3 组织学染色
在ICH后第3、7、28天用10% 水合氯醛麻醉小鼠,并先后用PBS和4%的多聚甲醛进行心内灌注。分离大脑并在4%多聚甲醛中固定过夜,然后在4 ℃下在30%蔗糖中浸泡72 h。在距前囟+1.2至-2.4 mm处以150 μm的间隔取冠状切片(厚25 μm)。将切片安装在载玻片上,用CV染色以测量病变体积,并将病变体积的变化定义为(CV无染色体积/对侧半球体积)×100%[11]。
1.4 模型小鼠的行为学测定
1.4.1神经功能评价 在手术后的第3、7、28、56天,由一名对小鼠分组不知情的实验者对小鼠神经功能进行评分。该评分标准包括身体对称性、步态、攀爬、盘旋行为、前肢对称性和强迫旋转六种功能。每种功能的评分为0~4,总分为0~24,得分越高表示神经系统损伤越严重[12-13]。
1.4.2糖水偏好实验 在建模后第56天进行。正式实验开始前,先让小鼠适应饮糖水48 h。具体操作为:前24 h每个鼠笼放置两瓶1%蔗糖水,24 h后将其中的一瓶换为纯水。适应之后进行基线值的测试。每笼各放置1%蔗糖溶液和纯水各一瓶,小鼠自由取水,禁食。12 h后测量剩余液体体积,分别记录蔗糖水、纯水及总液体消耗,测得小鼠的糖水偏爱百分比。糖水偏好百分比(%)=糖水消耗量/(糖水消耗量+纯水消耗量)×100%[14]。
1.4.3新物体识别测试 在建模后第56天进行。测试主要分适应期、熟悉期和识别期。第1天为适应期:将鼠放入测试盒的中间,让其自行适应性活动10 min。第2天为熟悉期:在测试盒中放入2个相同的玩具,将鼠从盒中距物体等距离处放入。第3天为识别测试期:将另外一套中的一个物体替换前一天中的一个玩具,将鼠放在盒中距两物体等距离处,计时10 min。每只鼠测试完成后,用酒精擦拭物体以消除鼠停留在物体上的气味。鼠的物体识别能力以第3天探索新旧物体的时间,并以探索时间计算分辨指数(discrimination index,DI)来评价。分辨指数计算公式为:DI=N/(N+F)×100%,式中N为在探索新物体 所用的时间,F为探索旧物体所用时间[15]。
本研究经过广州医科大学附属第二医院小鼠实验伦理审查委员批准(编号A2019-022)。
1.5 统计分析
2 结果
2.1 不同模型的血肿大小对比
WT模型组和Nrf2-/-模型组小鼠的血肿大小(占对侧半球的体积百分比)分别在第3天与第7天进行比较,结果显示2个时间点差异均无统计学意义(均P>0.05),见图1。
WT模型Nrf2-/-模型第7天第3天12341086420病灶占对侧半球体积百分比(%)
2.2 神经功能评分
WT假手术组和Nrf2-/-假手术组小鼠的神经功能评分在各时间点分别比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。WT模型组和Nrf2-/-模型组小鼠的神经功能评分在各时间点分别比较(分别在建模后第3/7/28/56天),差异均无统计学意义(均P>0.05)。见图2。
WT假手术组WT模型组Nrf2-/-假手术组Nrf2-/-模型组20151050神经功能评分2040600天数(d)
2.3 糖水偏爱试验
WT模型组和Nrf2-/-模型组小鼠的糖水消耗比例均较假手术组显著降低(均P<0.05)。与WT模型组比较,Nrf2-/-模型组小鼠的糖水偏爱比例也显著降低(P<0.05)。见图3A。
2.4 新物体识别试验
与假手术组比较,WT模型组和Nrf2-/-模型组小鼠的新物体探索时间比例均显著下降(P<0.05); 同时Nrf2-/-模型组小鼠的新物体探索时间较WT模型组也显著下降(P<0.05)。见图3B。
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3 讨 论
Nrf2与抑郁的关系研究是近年的热点[9]。本研究的结果显示,WT小鼠脑出血可引起明显抑郁症状,提示ICH的损伤可以直接导致抑郁症状。Nrf2-/-模型组小鼠的抑郁严重程度较WT模型组严重,提示Nrf2部分参与了ICH后抑郁症状的缓解,而缺乏Nrf2导致ICH后抑郁症状的加重。近期的研究提示多种因素参与了ICH后抑郁的发生:包括氧化应激、炎症、自噬及凋亡[16]。而Nrf2作为氧化应激与炎症反应的关键调控因子之一,被证明可通过抑制ICH后的氧化应激反应[16]、修复线粒体功能障碍[17]取得抗抑郁的作用。本研究与既往研究结论一致,即缺乏Nrf2可导致ICH后抑郁症状的加重。Nrf2是减轻ICH后抑郁症状的重要保护因素。
Nrf2与认知功能下降的关系研究虽然在近年逐渐受到关注,但多集中在缺血性脑血管病[18]、年龄相关的认知功能障碍[19]及阿尔茨海默病[10],在脑出血模型中的研究较少。本研究结果提示,与WT假手术组相比,Nrf2-/-假手术组小鼠无明显认知障碍。这与近期的研究结论一致,在未经模型干预的年轻小鼠中,WT与Nrf2-/-的组间认知功能无差异[19-20]。Nrf2-/-模型组小鼠的认知损伤严重程度较WT模型组严重,缺乏Nrf2会加剧ICH后认知损伤的程度,提示Nrf2参与了ICH后认知损伤的缓解。既往有研究发现出血性卒中如脑室出血后Src家族激酶激活,引起海马神经元破坏,是导致认知功能下降的原因[21],而这个过程可能是通过调节Nrf2的活性实现的[22]。近期的非ICH的血管性认知障碍小鼠模型研究提示:Nrf2的缺失加重了脑低灌注后的白质病理,但未加重认知功能障碍[20]。而本研究则提示ICH模型中Nrf2的缺失加重了认知功能障碍,提示Nrf2在缺血性和出血性两种病理状态下对认知障碍产生的机制存在差异的可能需要深入研究来阐明。
既往已有相关研究尝试把Nrf2当做ICH后神经损伤的治疗靶点:包括miR-27b的下调可以增加ICH大鼠模型中Nrf2的表达,从而抑制氧化应激反应、改善神经功能,且不影响ICH的病灶;而miR-27b的激活则起到了相反作用[23]。另外,NF-κB与NLRP3炎症体的抑制剂异曲霉素也通过上调Nrf2,激活抗氧化途径,减轻了ICH大鼠的神经损伤[24]。本研究在保持了模型的相同血肿体积和神经功能前提下,仍发现Nrf2-/-小鼠较WT小鼠的抑郁程度及认知功能更差,提示ICH后的情绪与认知功能的影响可能与神经功能损伤的作用通路并不一致,但本研究未能阐述其机制。
既往关于Nrf2在脑出血小鼠模型认知及情绪障碍中的研究十分有限,且没有控制血肿大小在上述改变中的影响。而本研究对血肿大小进行了控制,阐明了即使血肿大小一致,Nrf2的缺乏仍可导致抑郁及认知障碍的加重,为后续进一步探索Nrf2如何参与脑出血后抑郁及认知障碍的机制研究进行了铺垫。本研究存在以下不足:抑郁及认知障碍的行为学评价仅使用了单一的评分。今后的研究中将采用更多元的评价方式。其次,本研究使用了WT与Nrf2-/-小鼠进行对比,进一步的研究还需使用Nrf2激活剂进行验证。
综上所述,脑出血可导致小鼠抑郁情绪,而Nrf2 的缺乏能加剧小鼠抑郁情绪;脑出血可导致小鼠认知障碍,而Nrf2 的缺乏可加剧小鼠认知障碍。Nrf2参与脑出血后抑郁及认知障碍的机制需要进一步研究以阐明。