GeneXpert MTB/RIF检测技术在煤工尘肺并发肺结核患者中的诊断价值

杨晓丽 何兵 王皎磊 张云云 张春霞 李月 李建军 史文韬

2019年全国共报告职业性尘肺病患者15 898例[1]。尘肺病是致残性疾病,主要是肺组织广泛纤维化引起心肺功能损伤,致使患者劳动能力下降[2]。煤工尘肺是指煤矿工人长期吸入生产性粉尘所引起的尘肺的总称。在煤矿开采过程中由于工种不同，工人可分别接触煤尘、煤矽尘和矽尘，从而引起肺的弥漫性纤维化，统称为煤工尘肺[3]。煤工尘肺是严重危害煤矿职工身体健康的主要职业病，煤工尘肺患者是肺结核的好发人群，肺结核是尘肺患者的主要直接死因之一[4]。目前，煤工尘肺并发肺结核的主要诊断依据是胸部X线摄片(简称“胸片”)和痰液结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)的检查。由于矽肺患者胸片检查结果的多变性和不确定性，使痰液MTB检查结果成为矽肺患MTB感染和结核病复发确诊的直接病原学证据[5]。

肺结核的诊断主要依靠痰涂片抗酸染色和痰分枝杆菌培养。我国常规应用的结核病实验室诊断方法，如涂片显微镜检查，敏感度较低；痰培养具有较高的敏感度，但耗时较长。现有的结核病实验室诊断标准均不能满足临床早期、快速诊治的需要，可能延误诊断和治疗，开发敏感度高、耗时短、成本低廉并易普及的检测方法成为大势所趋[6]。GeneXpert MTB/RIF(简称“Xpert”)检测技术是一种操作简便、快速、敏感度和特异度高、对操作人员安全的重要方法[7]。同时，Xpert技术能同时检测利福平耐药情况，并能提高低含菌量标本的检出率，可更好地辅助临床医生及早诊疗和及时预防隔离[8]。本研究采用Xpert检测技术对煤工尘肺并发肺结核患者的晨痰进行检测，观察其在煤工尘肺并发肺结核患者中的诊断价值。

资料和方法

一、 研究对象

选取2019年1月至2020年12月在北京京煤集团总医院诊治的64例煤工尘肺并发肺结核患者作为研究对象；均为男性，年龄39～87岁，中位年龄66岁。尘肺病诊断依据《GBZ 70—2015 中华人民共和国国家职业卫生标准》[9]进行，结核病诊断依据《WS 196—2017 结核病分类》[10]和 《WS 288—2017 肺结核诊断》[11]进行诊断。留取患者晨起合格痰标本3～5 ml，各取1 ml分别加入到3个前处理管中，分别进行痰抗酸杆菌涂片、痰分枝杆菌培养、Xpert检测。

二、 试验材料

分枝杆菌涂片镜检采用萋尼染色方法，购自珠海贝索生物技术有限公司，培养采用BACTEC MGIT 960液体培养(简称“MGIT 960培养”)系统，由美国BD公司生产。Xpert检测系统及其配套试剂盒(Cartrige 反应盒)购自美国Cepheid公司，产品技术编号为国械注进20173406215。

三、 Xpert检测方法

取1 ml痰标本放入前处理管中，加入相当于痰标本体积两倍的SR痰标本处理液中，将前处理管置于漩涡振荡器上振荡20 s左右，直到无可见块状痰标本为止，静置15 min，用试剂盒中的无菌吸管取2 ml液化后的样品由加样孔缓慢转移到Cartridge反应试剂盒中，然后将Cartridge反应试剂盒放入检测模块中，仪器进行自动化检测，2 h后仪器自动判读出结果、含菌量及是否对利福平耐药。如果6条探针中，除质控探针外有≥2条探针发出荧光，则提示MTB感染，根据Ct值的不同可对MTB浓度进行高(Ct值<16)、中(16≤Ct值<22)、低(22≤Ct值≤28)判定。5条探针如果未全部发出荧光，则说明对利福平耐药。

四、 统计学处理

建立Excel数据库收集数据，采用SPSS 19.0软件进行数据处理，组间阳性检出率的比较及不同检测方法间的敏感度、特异度、一致率的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。本研究的各项指标相关定义如下：敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%,特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%,阳性预测值=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)×100%,阴性预测值=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)×100%。各方法间的一致性检测采用Kappa检验，Kappa值≥0.75，说明两种方法诊断一致性较好；0.4≤Kappa值<0.75说明两种方法诊断一致性中等；Kappa值<0.4，说明两种方法诊断一致性较差。同时，分别绘制两种技术结核病诊断的受试者工作特征曲线(ROC曲线)，根据ROC曲线下的面积(AUC值)评价诊断结果的准确性。

结 果

一、以MGIT 960培养为金标准，比较Xpert检测与痰涂片法对MTB的检测效能

MGIT 960培养阳性患者18例，涂片阳性患者6例，Xpert检测阳性患者28例。以MGIT 960培养法为金标准，涂片法与Xpert检测对病例组患者MTB检测的敏感度分别为27.8%(5/18)、88.9%(16/18)；特异度分别为97.8%(45/46)、73.9%(34/46)；阳性预测值分别为5/6、57.1%(16/28)，阴性预测值分别为77.6%(45/58)、94.4%(34/36)。两种方法的一致率均为78.1%。Xpert检测敏感度高于涂片法，差异有统计学意义(χ2=13.829，P=0.000)；涂片法特异度高于Xpert检测，差异有统计学意义(χ2=10.839，P=0.001)。Xpert检测的失败率和污染率均为0。

二、痰涂片与Xpert检测结果一致性分析

Xpert检测与MGIT 960培养一致性为78.1%(50/64)(Kappa=0.537)，两者具有中等一致性。痰涂片与MGIT960培养一致性为78.1%(50/64)(Kappa=0.321)。对于涂阴煤工尘肺并发肺结核患者，Xpert检测的阳性率为36.2%(21/58)；MGIT 960培养阴性的46例患者中，Xpert检测MTB阳性率为21.7%(10/46)，涂片阳性率为2.2%(1/46)，两种检测方法比较差异有统计学意义(χ2=8.364，P=0.004)。Xpert 检测与痰涂片检测的AUC值分别为0.836、0.628(图1)。

图1 Xpert MTB/RIF检测与痰涂片检测煤工尘肺并发肺结核的ROC曲线

三、两种方法检测煤工尘肺并发肺结核患者对利福平耐药情况

64例患者的痰标本均进行MGIT 960培养，共得到18例分枝杆菌阳性菌株，经菌种初步鉴定，均为MTB。MGIT 960药物敏感性试验(简称“药敏试验”)与Xpert检测分别有4例和7例耐利福平。以MGIT 960药敏试验结果为标准，Xpert检测利福平耐药的敏感度为100.0%，特异度为78.6%，阳性预测值为57.1%，阴性预测值为100.0%，一致性为83.3%，两种方法检测利福平耐药的差异有统计学意义(χ2=4.889，P=0.027)。两种检测方法的Kappa值为0.620，两者具有中等一致性(表1)。

表1 以MGIT 960药敏试验为标准评价Xpert对两组患者利福平耐药性的检测效能

讨 论

Mirsadraee等[12]对伊朗和韩国1980—2011年间报道的6280例煤工尘肺患者进行Meta分析，发现22.5%并发肺结核，明显高于非尘肺对照组。矽肺并发肺结核患者痰中变异的L型MTB、抗酸染色呈阴性及肺部严重纤维化、支气管扭曲变形致痰液引流不畅均可造成结核病的漏检及误诊[13]。

Xpert检测是基于定量PCR的分子生物学检测，能够从已经灭活的MTB中扩增出MTB核酸并报告诊断，可出现痰培养阴性而Xpert检出阳性的情况。本研究中，液体培养阴性的46例患者中，Xpert检测MTB阳性患者10例(21.7%)，涂片阳性1例(2.2%)，两种检测方法比较差异有统计学意义。Xpert能检测出MTB含量较低的标本，可提高低含菌量标本的阳性率。对于涂阴煤工尘肺并发肺结核患者，Xpert检测的阳性率为36.2%，这些患者无法通过痰涂片检测MTB进行诊断，容易漏诊。因此，Xpert检测可以明确诊断，早诊断、早治疗，避免误诊误治。

本研究中Xpert检测在煤工尘肺并发肺结核患者中的敏感度(88.9%)、阴性预测值(94.4%)均较高，而特异度、阳性预测值相对较低。Xpert检测因其简便、快速、敏感度高且能同时检测利福平耐药菌株等优点，在临床结核病筛查诊断中具有较好的应用价值[14]。Steingart等[15]报道，Xpert检测总敏感度为89%，对涂片阳性样本，敏感度达98%，对涂片镜检阴性的标本敏感度为67%，总特异度为99%。Pimkina等[16]报道，Xpert 检测对培养阳性患者敏感度为93.7%，特异度为91.7%，对于涂片阴性样本的敏感度为82.5%。本研究Xpert 检测敏感度与上述研究基本相似，但特异度均低于上述结果。周银发等[17]研究以痰固体培养为标准， Xpert检测MTB的敏感度与阴性预测值均较高，但特异度与阳性预测值均较低，两种检测方法的结果呈中度一致。也有文献显示，以传统固体痰培养为金标准，在涂阴疑似肺结核患者中Xpert检测MTB的敏感度为55.2%～90.2%[18]。本文结果与这两项研究相符。分析原因可能为：(1)标本菌量太低，超出Xpert检测的下限；(2)可能存在PCR抑制因子；(3)样本量较少；(4)考虑与实验方法、研究对象自身局限性有关，矽肺患者由于全身免疫力和防御机能的下降，加之二氧化硅对MTB活力和毒性的增强作用，同时，肺组织的缺血和缺氧等因素不利于MTB的生长，其肺内长期生存的MTB可产生适应性改变，在形态、毒力、抗原性及药物敏感性方面发生变异[19]。Xpert检测结果一致性及ROC曲线下面积均优于痰涂片。相较于传统实验室诊断方法，Xpert对煤工尘肺并发肺结核诊断的准确性高，且极大地缩短了检测时间。

以MGIT 960药敏试验结果为标准，煤工尘肺并发肺结核患者Xpert检测利福平耐药的敏感度为100.0%，特异度为78.6%。张治国等[20]研究显示，以传统药敏试验为金标准，Xpert检测利福平耐药的敏感度为 89.1%，特异度为 96.3%。Boehme等[21]研究显示Xpert检测利福平耐药的敏感度为 97.6%，特异度为 98.1%，特异度均高于本研究。在煤工尘肺并发肺结核患者中，两种方法检测利福平耐药差异有统计学意义；当然，关于Xpert检测的假耐药性问题也不容忽视，目前已升级至G4版本，以提高耐药检测的特异度。但最近研究报道，Xpert检测的假耐药患者，给予一线抗结核药物后可成功治愈，提示目前仍未解决假耐药性问题[22-24]。

本研究中，在痰涂片、液体培养检测为阴性的患者中仍有患者核酸检测阳性，且对这些患者进行重复试验均为阳性，充分印证了在煤工尘肺并发肺结核患者的辅助诊断中核酸检测的高敏感度。有30%～60%的肺结核患者无细菌学依据[25]，导致涂阴肺结核患者误诊误治，其病亡率接近20%[26]。结核病的早期诊断及其耐药性的检测，对于很好地控制耐药结核病的传播具有十分重要的意义[20]。由于部分非结核分枝杆菌中也存在rpoB基因或类似基因，故理论上Xpert检测有假阳性的可能，但有报道显示[15]，非结核分枝杆菌造成假阳性的比例仅为0.6%。WHO进一步更新了推荐，认为Xpert检测可作为涂阴肺结核患者进一步明确结核病诊断的后续检测方法[27]。

综上所述，Xpert检测是一种速度快、敏感度高的MTB感染的辅助诊断方法，在煤工尘肺并发肺结核患者中具有较高的临床应用价值，Xpert检测可作为临床快速检测MTB及其利福平耐药性的筛选试验。在一些结核病基层医疗机构，一定程度能降低漏诊率，使患者尽早进行有效抗结核治疗，减少煤工尘肺与结核病对机体造成的协同损害作用，从而减少患者痛苦，降低患者病亡率。