GeneXpert MTB/RIF技术对宁夏地区快速发现肺结核及利福平耐药患者的应用效果评价

刘静 肖慧霞 田晓梅 王福锐 田旭升 王晓平 陈敏 雷娟 王晓林

实验室诊断是实现结核病早发现、早隔离、早治疗的基础，诊断滞后将直接导致个体治疗的延误和结核分枝杆菌在人群传播控制的失败。结核病实验室诊断是结核病患者发现的重要途径，然而传统检测方法如抗酸染色涂片、痰培养等方法由于检测敏感度低和周期长等缺点，已无法满足临床需求，亟待推广和使用新型的诊断技术。2010年，WHO推荐将GeneXpert MTB/RIF(以下简称“GeneXpert”)用于结核病的快速诊断和利福平耐药性检测。2016年，国家卫生和计划生育委员会发布的《关于进一步加强结核病防治工作的通知》[1]中明确提出要强化结核病患者发现，加快推广成熟的耐多药结核病快速检测技术。2017年，我国发布的《WS 288—2017 肺结核诊断》中将分子生物学方法作为确诊患者的诊断依据之一[2]。GeneXpert是半巢式荧光定量PCR检测系统，具有快捷、安全、敏感度高、特异度高的特点，同时其对实验室环境要求低，易于被基层人员掌握操作，可在2.5 h内确定是否有结核分枝杆菌及是否耐利福平，备受国内外认可[3-6]。

宁夏回族自治区(简称“宁夏”)于2016年开始逐步推广分子生物学检测技术，于2018年实现了GeneXpert全自治区覆盖，笔者就宁夏地区应用GeneXpert检测技术前后，分年度、分地区对肺结核患者及耐药患者发现的变化进行效果评价，为新技术在基层结核病定点医院大规模推广提供借鉴经验。

资料和方法

一、资料来源

病例资料来源于《中国疾病预防控制信息系统》的子系统《结核病信息管理系统》中宁夏2016年、2018—2020年的结核病登记数据，研究数据中已去除单纯结核性胸膜炎、肺外结核患者。2016年肺结核诊断参考《WS 288—2008 肺结核诊断标准》[7]，2018年后肺结核诊断参考《WS 288—2017 肺结核诊断》[2]。

二、宁夏地区GeneXpert检测技术使用情况及耐药筛查流程

宁夏共有结核病实验室23家。2016年，宁夏借助中国国家卫生健康委员会-比尔及梅琳达·盖茨基金会结核病防治项目的实施，首先在1个省级、5个市级及7个地市县区共13家定点医院实验室开展了GeneXpert检测，筛查对象为痰涂片阳性患者。其他未开展GeneXpert检测的市属县区定点医院负责收集涂阳肺结核患者标本，派专人专车将标本送至市级或附近县区进行检测。见图1。

图1 2016年宁夏结核病筛查流程

2017年7月，宁夏全部定点医院结核病实验室均配备了GeneXpert检测仪器，开展质量控制，通过质量控制后再常规开展该项目。但是时间不一致，因此没有对数据进行分析。筛查对象及流程仍执行2016年筛查流程，故本研究不分析2017年的数据。

2018年3月，GeneXpert检测设备及技术覆盖全自治区，且修改制定了实验室耐药筛查流程，将耐药筛查对象由原来的涂阳和培阳患者扩大到所有活动性肺结核患者。见图2。

图2 2018—2020年宁夏结核病筛查流程

三、检测方法

抗酸染色涂片法：采用分枝杆菌金胺O荧光染色法染色，LED显微镜镜检。操作过程按照《结核病实验室检验规程》[8]进行。

GeneXpert检测：严格按照说明书及《结核病实验室检验规程》[8]操作，前处理管中以1∶2加入痰标本和样本处理液，吸取痰标本时选取脓性及黏稠部分，漩涡振荡10 s，室温静置15 min，待痰液充分液化后吸取2 ml至Cartridge试剂盒，上机检测。

四、研究内容

以2016年年度数据为基线，分别与2018—2020年各年度及宁夏5个地级市活动性肺结核患者的GeneXpert检测率、病原学阳性数、利福平耐药患者数和涂阴患者中GeneXpert检测到的阳性患者数及利福平耐药患者数进行比较，评价宁夏地区应用GeneXpert检测技术前后，肺结核患者快速发现及耐药患者发现的变化。

五、质量控制

全区结核病实验室均参加并通过国家组织的药物敏感性试验(简称“药敏试验”)熟练度及分子诊断技术能力验证。各级实验室工作人员每年均接受省级统一培训，省级结核病参比实验室人员每年进行2次培训，地市级实验室人员每季度进行1次培训，对所辖县区的实验室进行现场督导及涂片盲法复检。

GeneXpert室内质控包含样本处理质控和探针检查质控。每份样本检测质控通过为有效结果，样本处理质控不合格则结果无效，探针检查质控不合格则结果错误，当检测系统中途停止使仪器未收集到数据则无结果。

六、统计学处理

采用SPSS 20.0统计分析软件处理数据。计数资料组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、活动性肺结核患者GeneXpert检测情况

2016年、2018—2020年，宁夏地区活动性肺结核患者共8851例，活动性肺结核患者中进行GeneXpert检测的患者数为5816例。2016年、2018—2020年GeneXpert检测率见表1。各年度间GeneXpert检测率的比较差异有统计学意义(χ2=2929.500，P=0.000)。2016年、2018—2020年由于探针检查质量控制不通过而导致错误的检测占比为2.53%(147/5816)，由于系统中途停止而导致无数据的检测占比为0.05%(3/5816)，由于样本处理不合格引起的无效检测占比为0.70%(41/5816)。各年度GeneXpert检测错误、无结果及无效检测情况具体见表2。

表1 2016年和2018—2020年宁夏活动性肺结核患者GeneXpert检测情况

表2 2016年和2018—2020年宁夏活动性肺结核患者GeneXpert检测未得到检测结果的情况

2016年全省5个地级市的GeneXpert检测率平均为22.55%，各市GeneXpert检测率差异无统计学意义(χ2=8.743，P=0.068)。2018—2020年，银川市GeneXpert检测率最高(89.29%)，固原市检测率最低(70.01%)，全自治区GeneXpert平均检测率为81.59%，各市GeneXpert检测率差异有统计学意义(χ2=190.245，P=0.000)。见表3。

表3 2016年和2018—2020年宁夏各地级市肺结核患者GeneXpert检测率

二、肺结核患者病原学阳性率及涂阴患者的GeneXpert检测情况

2016年，宁夏病原学阳性率为36.20%(862/2381)。2018—2020年，通过GeneXpert检测，病原学阳性率不断提高，3年的平均病原学阳性率为57.51%(3721/6470)，较2016年升高了1.6倍。各年度病原学阳性率差异有统计学意义(χ2=359.543，P=0.000)。2016年未对涂阴患者进行GeneXpert检测，2018—2020年在涂阴活动性肺结核患者中共发现了583例结核病患者，这部分患者占病原学阳性患者数的15.67%(583/3721)。各年度涂阴患者中检测到的阳性患者数占病原学阳性患者的比例差异有统计学意义(χ2=162.119，P=0.000)。见表4。

表4 2016年和2018—2020年宁夏肺结核患者病原学阳性率及涂阴患者的GeneXpert检测情况

2016年银川市、石嘴山市、吴忠市、固原市、中卫市病原学阳性率分别为43.72%、 52.21%、

37.13%、21.45%、38.33%；2018—2020年分别为59.53%、63.32%、57.17%、47.54%、61.01%；5个地市2018—2020年与2016年相比病原学阳性率差异均有统计学意义(χ2=47.478，P=0.000；χ2=5.871，P=0.015；χ2=69.523，P=0.000；χ2=108.440，P=0.000；χ2=68.497，P=0.000)。在涂阴活动性肺结核患者中，2018—2020年5个市涂阴患者GeneXpert阳性数占病原学阳性患者的比例差异有统计学意义(χ2=51.586，P=0.000)。见表5。

表5 宁夏各地市2016年和2018—2020年肺结核患者病原学阳性率及涂阴患者的GeneXpert检测情况

三、 GeneXpert检测对利福平耐药患者的发现情况

2016年和2018—2020年共发现利福平耐药患者299例，其中通过GeneXpert检测发现的患者为291例，年度间差异有统计学意义(χ2=12.193，P=0.007)；在涂阴肺结核患者中，2018—2020年通过GeneXpert共发现利福平耐药患者64例，占利福平耐药患者总数的21.40%。见表6。

表6 2016年和2018—2020年宁夏GeneXpert检测对利福平耐药患者的发现情况

讨 论

2016年8月，宁夏参与了中国国家卫生健康委员会-比尔及梅琳达·盖茨基金会结核病防治项目，在项目实施期间，宁夏积极推广GeneXpert检测技术，各市县人员培训由宁夏结核病防治所统一组织进行，且试剂发放、仪器的维护保养由省级结核病防治所经费支持及协助联系，解决了人员操作技术及试剂供应的问题，2018年实现了全省结核病实验室检测“分子化”，并不断完善耐药筛查流程。

本研究显示，2016年、2018—2020年，全省活动性肺结核患者总数为8851例。2020年，受新型冠状病毒肺炎疫情的影响，活动性肺结核患者发现数略有降低。全省活动性肺结核患者GeneXpert检测率逐年升高，从2016年的22.55%上升至2020年的89.78%。原因可能为2016年仅有13家实验室开展该项目的检测，而2018年起，GeneXpert检测技术在全省5市22个县全面配备且开展；另一方面，筛查对象从2016年的涂阳患者扩大到2018年的活动性肺结核患者，筛查范围扩大。另外，GeneXpert未得到检测结果的比例为3.28%，提示试剂本身的探针检查及实验操作过程中样本的处理环节需要特别注意及加强。

全自治区5个地市中，银川市GeneXpert检测率最高，固原市检测率最低。原因可能为银川是宁夏的首府，外来务工人员及大学生群体的流动增加了城市人口基数，且银川市结核病患者推荐、转诊及患者管理到位，工作落实较好，患者自身防病意识较高，使得银川市活动性肺结核患者发现数最多；而石嘴山市属于工业城市，人口基数少，其活动性肺结核患者及检测例数最少。全区活动性肺结核患者的GeneXpert平均检测率为65.71%，而固原市四年活动性肺结核患者平均GeneXpert检测率低于全区平均水平。固原市属于山区，2018年前部分县区没有配备GeneXpert检测仪器时要将患者痰标本运送至附近市县进行检测，部分县区由于经济欠发达，防病意识薄弱，人员聚集性强，且交通不便导致标本运送频率低、周期长等都是该市检测率低于全区平均水平的影响因素。

从病原学阳性率数据来看，2016年宁夏病原学阳性率为36.20%，2018—2020年的平均病原学阳性率升至57.51%。2016年的耐药筛查流程仅对涂阳患者进行GeneXpert检测，2018年修订的耐药筛查流程将GeneXpert检测对象从涂阳患者扩大到活动性肺结核患者。将涂阴肺结核患者纳入GeneXpert的筛查范围后，2018—2020年涂阴患者中GeneXpert阳性的患者占病原学阳性的比例为15.67%，略低于黄芳等[9]和沈雷雷等[10]的研究结果，这是非常重要的一部分患者发现，对《“十三五”全国结核病防治规划》[11]中提出的结核病病原学诊断阳性率50%指标的达到和提升有重大贡献，并且通过GeneXpert的检测，利福平耐药患者诊疗时间大为缩短，为进一步做到早发现、早诊治，及时控制传染源提供了基础。银川市的涂阴患者中GeneXpert阳性数占病原学阳性的比例最高，与省级结核病参比实验室严格控制送检痰标本质量，拒收口水痰、食物残渣痰有关。

在利福平耐药患者发现方面，GeneXpert检测意义重大。2016年以前，宁夏大多数耐药患者的发现主要依靠传统药敏试验。药敏试验的操作流程比较复杂，报告周期长，且易被污染，假阳性率高，加之基层实验室人员轮换频繁，操作不够规范等因素，长期以来，宁夏结核病病原学阳性率和耐药筛查率较低。在项目实施期间，GeneXpert检测到的利福平耐药患者数占总耐药患者数的97.32%，在涂阴患者中检测到的利福平耐药患者占涂阴耐药患者的21.40%。对于这部分患者，如果通过传统培养及药敏试验方法被发现，需要6～8周的时间，由于时间较长，患者无法第一时间得到救治，极大的延误治疗时间，而应用GeneXpert检测能在2.5 h给出明确的利福平药敏试验结果。欧维正等[12]和虞忻等[13]的研究显示，约90%的利福平耐药患者同时对异烟肼耐药，临床可参考GeneXpert的利福平检测结果在最短时间内拟定治疗方案，同时进行培养和传统药敏试验，不再使阳性耐药患者继续成为“行走的传染源”，大大降低耐药结核病的传播风险。

综上所述，宁夏在全自治区推广应用GeneXpert检测技术及将活动性肺结核患者纳入筛查对象后，基层结核病定点医院实验室的检测能力明显提升，对结核病患者，尤其是涂阴肺结核患者及耐药患者的发现大大提高，说明该方法在基层定点医院是适合推广的，在以后的工作中应当进一步强化基层结核病定点医院的作用，继续探索适合本地区的结核病发现管理模式，使宁夏结核病防治工作踏上新的台阶。