结核分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖的免疫调节作用和诊断价值

范雨鑫 刘玫肖 陈晶晶 徐鑫 张宇 岳鹏 曹文静 宝福凯 柳爱华

目前，结核病发病机制仍然欠清晰、诊断方法不够理想，患者得不到及时诊断，导致预后不良，疾病广泛传播，医疗保健费用增加。因此，迫切需要新的检测方法或生物标志物来实现对结核病患者的早期诊断和及时治疗，进而提高结核病患者生存率，控制疾病传播。结核分枝杆菌的细胞壁主要是以分枝杆菌基-阿拉伯半乳聚糖-肽聚糖复合物(mycoly-larabinogalactan-peptidoglycan，mAGP)为基础的大分子结构[1]，其他的一些脂类，如磷脂酰肌醇甘露糖苷(phosphatidyl-myo-inositol mannosides，PIM)及其衍生的糖脂、脂甘露聚糖(lipomannan，LM)和脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan，LAM)，也存在于细胞壁中，这些结构对结核分枝杆菌的生长、生存和毒力至关重要。笔者综述了LAM在免疫反应中的作用及在结核病诊断中的应用，为其可能作为一种新的结核病诊断生物标志物提供了新的视野与思路。

LAM的分子结构

20世纪30年代，Masucci等从分枝杆菌细胞壁中分离出一种血清活性多糖，经过对该多糖的鉴定，发现其主要含有阿拉伯半乳聚糖(arabinogalactan，AG)、LAM及甘露聚糖(lipomannan，LM)[2]。其中，LAM是一种以磷脂酰肌醇(phosphatidyl inositol，PI)为基础的具有多种生物活性的脂聚糖[3]，主要由一个脂质锚点，即甘露糖基磷脂酰肌醇(mannosyl phosphate inositol，MPI)，一个d-甘露聚糖和d-阿拉伯聚糖组成的多糖骨干和甘露糖帽三部分构成(图1)。

图1 LAM的结构示意图

耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)的LM和LAM结构缺陷可导致其不能进行抗酸染色，对β-内酰胺类抗生素敏感性也增加，使其更快地被巨噬细胞杀死[4]，所以阐明这些重要分子的完整结构有助于阐明结核病发病机制，以及提供新的诊断手段。

一、PIM的结构

PIM为一种糖脂，是LAM、LM的前体分子，含有一个PI单位。PI单位由脂肪酸磷酸二酯连接的肌醇构成，当肌醇的O-2和O-6位被甘露糖基糖基化后，形成MPI (图2)。在PIM基础上形成的MPI是一种典型的糖基磷酸肌醇锚(glycosyl phosphate inositol anchor，GPI)衍生物，其结构异质性可随脂肪酸的数量、位置和性质发生变化[5]。

图2 磷脂酰肌醇甘露糖苷与甘露糖基磷酸肌醇化学结构示意图

分枝杆菌中最丰富的PIM类型是PIM2(Ac1PIM2、Ac2PIM2)和PIM6(Ac1PIM6、Ac2PIM6)，它们是合成LAM及LM α(1→6)甘露糖骨架的关键模块。在Ac1PIM2和Ac2PIM2中，MPI作为锚定点可进一步被甘露糖和阿拉伯糖糖基化，产生不同形式的PIM、LM和LAM[6]。

二、LAM的结构

在所有分枝杆菌中，LAM和LM都含有一个甘露糖骨架，这个甘露糖骨架由5～10个α(1→2)甘露糖基周期性修饰21～34个α(1→6)甘露糖基所组成[7]，PIM2则在α(1→6)方向与甘露糖骨架相连。

成熟的甘露糖骨架会进一步与55～72个阿拉伯糖残基组成的阿拉伯聚糖结构域相连，形成LAM[8-9]。阿拉伯糖链的大部分末端阿拉伯糖单位可以连接到2～4个含甘露糖的寡糖，称为甘露糖帽基序(mannose cap motif，MCM)。根据分枝杆菌种类的不同，MCM也不同。在结核分枝杆菌和其他致病性分枝杆菌中，LAM的阿拉伯糖链末端连接数个甘露寡糖形成甘露糖修饰的脂阿拉伯甘露聚糖(mannose-capped lipoarabinomannan，ManLAM)[10]，而在非致病性分枝杆菌中，LAM的阿拉伯糖链末端连接磷酸肌醇，形成磷酸肌醇修饰的脂阿拉伯甘露聚糖(phospho-myo-inositol-capped lipoarabinomannan，PI-LAM)[11](图1)。

LAM诱导的免疫应答与免疫调节

结核分枝杆菌感染可能使宿主患活动性结核病，但在大多数情况下细菌持续存在于受感染的宿主中，没有临床症状，形成结核分枝杆菌潜伏感染。这些不同的感染状态很大程度上取决于入侵的结核分枝杆菌和宿主免疫系统之间的相互作用。

一、LAM诱导的固有免疫反应

在固有免疫应答中，巨噬细胞和树突状细胞(DC细胞)等免疫细胞可以通过其表达的模式识别受体(pattern recognition receptors，PRR)识别结核分枝杆菌细胞壁上的某些成分，进而产生免疫反应。其中Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)[12-13]和C型凝集素受体(C-type lectin receptors，CLR)与宿主识别结核分枝杆菌密切相关，其识别的目的是通过内吞作用吞入细菌并随后消灭细菌[14]。

LAM的前体分子PIM和LM等都有激活或抑制免疫功能的作用，不同毒力的实验室结核分枝杆菌菌株(Erdman、H37Rv、H37Ra、BCG)的分子结构、内部异质性和丰度存在差异，在结核分枝杆菌临床分离株中也观察到LAM的甘露糖帽末端阿拉伯糖基的变化，这可能与菌株生物活性的不同有关[15]。因此，ManLAM、LM和PIM可能是结核病发病机制中与结核分枝杆菌毒力强弱有关的关键因素。

ManLAM是一种病原体相关分子模式(pathogen-associated moleculer patterns，PAMP)，可以被TLR及CLR识别，进而启动局部免疫应答，产生大量细胞因子。当巨噬细胞被细胞因子和固有免疫受体激动剂激活时可以直接发挥杀菌效应，DC细胞可以吞噬感染组织中的细菌，迁移到引流淋巴结，激活初始T和B淋巴细胞启动适应性免疫反应[16]。

二、LAM和T细胞介导的免疫

T细胞介导的免疫应答在结核病的保护性免疫中起着重要作用。CD8+T淋巴细胞具有细胞毒活性，能够通过凋亡相关蛋白Fas和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)介导的杀伤机制，以及胞外释放穿孔素和颗粒酶等机制清除被结核分枝杆菌感染的细胞[17]。

以往研究认为，糖脂类不会诱导T细胞介导的免疫[18-19]，但随着研究的深入，发现LAM及其结构变体可以识别并激活CD1限制性T细胞。在识别分枝杆菌脂质后，CD1限制性T细胞被激活，分泌促炎细胞因子(如γ-干扰素等)，并发挥细胞溶解和杀菌活性[19-21]。CD1限制性T细胞可表达穿孔素和颗粒酶B，限制细菌的生长，提示了一种可能的预防结核病的机制[22]。

三、LAM诱导的体液免疫

体液免疫可以调节机体对病原体的免疫应答，但体液免疫在结核病中的作用一直存在争议。随着研究的进展，体液免疫在抗结核免疫中的重要作用逐渐被揭示。抗体可通过Fc受体介导的吞噬和抗体依赖的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)来调节免疫应答，从而对许多细胞内病原体发挥抗菌免疫作用[23]。抗分枝杆菌的抗体可在自然感染过程中形成，在活动性结核病期间，抗体反应尤为显著，尽管这种抗体的亲和力较低，但已证明这类特异性抗体可能阻止结核分枝杆菌的体内播散[24]。在儿童中，抗LAM IgG抗体的存在与结核分枝杆菌播散呈负相关，这提示抗LAM抗体可能在限制结核分枝杆菌播散方面发挥重要作用[23]。

四、LAM在抗结核免疫中的免疫调节作用

结核分枝杆菌具有解除吞噬细胞杀菌作用的能力，即将杀菌的吞噬细胞转化为可自我复制的安全避难所。ManLAM 存在于结核分枝杆菌表面，是PRR的配体，可以启动免疫反应，TLR及CLR都可与结核分枝杆菌表面的LAM紧密结合，这种结合可以导致结核分枝杆菌的有效内化，也是结核分枝杆菌进入吞噬细胞发挥毒力效应的重要分子[25]。LAM作为结核分枝杆菌的毒力因子，可以通过阻断CD4+T淋巴细胞激活的传统T细胞受体(T cell receptor，TCR)依赖途径中一些关键分子的磷酸化，影响T细胞的活化[26]。Wong等[27]研究表明，结核分枝杆菌感染机体后，白细胞介素-10(interleukin，IL-10)等调节因子的存在有利于结核分枝杆菌在体内的生存，而LAM可以通过识别B细胞(B-10)表达的TLR2，促进IL-10的表达，延缓机体免疫系统对结核分枝杆菌的清除。

此外，ManLAM也可以作为一种可溶性分子，进入吞噬细胞后从感染的巨噬细胞以外泌体或凋亡小泡的形式传递到未被感染的抗原提呈细胞，促进T细胞的活化[28]。ManLAM 还具有几种显著的免疫抑制特性，包括抑制促炎细胞因子的产生、抑制吞噬体的成熟、抑制巨噬细胞凋亡和抑制自噬，这些抑制作用可能是结核分枝杆菌形成潜伏感染的重要原因[14]。

LAM作为结核病诊断的生物标志物

传统的肺结核的诊断，主要依赖于痰液抗酸杆菌涂片和对临床标本中结核分枝杆菌的培养，痰涂片敏感度仅为22%～43%，而结核分枝杆菌培养是一项耗时的工作，可能需要6～8周甚至更长时间才能得到结果[29]。在新发现的结核病病原学快速诊断方法中，聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)具有较高的敏感度和特异度，成为比较理想的方法之一，WHO目前推荐Xpert MTB/RIF作为疑似结核病患者的初始检测手段。但是，基础设施和环境条件不足、缺乏仪器维护支持，以及技术人员的高流动性等问题成为了许多发展中国家和偏远地区使用这项技术的障碍[30]。

一、LAM作为诊断结核病的生物标志物

结核分枝杆菌潜伏感染的诊断可依赖结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test，TST)或γ-干扰素释放试验(inter-feron-γ release assays，IGRA)，但无论是TST还是IGRA都不能帮助判断结核分枝杆菌潜伏感染是否会发展为活动性结核病。TST特异度较低，在卡介苗(bacille Calmette-Guérin，BCG)接种人群和非结核分枝杆菌感染患者的检测中可能出现假阳性结果[31]。与TST相比，IGRA具有更高的特异度与敏感度，但对HIV感染患者的检测作用有限，其高成本等问题也限制了IGRA的潜在效益[32]。

LAM作为结核分枝杆菌特有的细胞壁主要成分，是检测结核分枝杆菌抗原的理想候选物[33]。20世纪90年代，Sada等[34]将LAM作为抗原，用ELISA技术检测了66例肺结核、粟粒性结核病、结核性胸膜炎、淋巴结结核患者血清中的抗LAM IgG抗体，他们发现与之前其他纯化抗原的研究数据相比较，该抗原的敏感度可达72%，特异度高达91%。此外，相较于IGRA，LAM检测在HIV感染者中可能得到更多的应用。

在结核分枝杆菌感染期间，LAM存在于机体体液中，可以作为一种潜在的生物标志物来识别机体的感染状态。结核分枝杆菌潜伏感染的发展是一个连续的过程，可以从持续的非进展性感染和亚临床感染进展到活动性疾病[35]，理论上，结核分枝杆菌潜伏感染者发展为活动性结核病时，患者体内的细菌新陈代谢活跃性增加。结核病患者LAM测定可部分反映细菌负荷，是诊断结核分枝杆菌潜伏感染及监测抗结核治疗有效性的工具[10, 36-37]。

二、LAM检测的应用

结核病最常见的死亡原因是并发HIV感染。因为种种原因无法获得患者痰标本或者痰标本检测阴性，导致结核病得不到有效及时的诊断。对于这类脆弱群体，开发新的、快速的、不基于痰液的诊断方案来检测结核病显得尤为重要。目前，脑脊液和胸腔积液LAM检测也处于研究中，但很少在结核性脑膜炎患者的脑脊液中或胸腔积液中发现LAM[38]。由于痰液的黏度和干扰基质的影响，痰液LAM检测的效果也不是很理想[39]，且一些口腔微生物如念珠菌和多种放线菌细胞壁表面分子与LAM存在交叉反应，可能导致痰液LAM检测的特异度较低[40]。

(一) 尿液LAM检测

LAM是通过肾脏过滤的，可以从尿液中检测到[41]，尿液是一种无菌且容易获得的体液，即使是痰液缺乏的患者也可以进行检测，且LAM是一种具有热稳定性的抗原，即使在煮沸的尿液中，也可以通过敏感的免疫学技术检测到LAM[42]。

有研究表明，尿液LAM检测可能会提高活动性结核病诊断的准确性，特别适用于并发HIV感染和低CD4+T淋巴细胞计数的重症患者，尿液LAM检测的敏感度与CD4+T淋巴细胞计数可能呈负相关。对于CD4+T淋巴细胞计数小于50个/mm3的患者，尿液LAM检测的敏感度可达56%～85%，特异度达88%，这可能是因为晚期免疫缺陷患者高分枝杆菌负荷和结核分枝杆菌全身传播导致尿液中高水平的LAM[40, 43-44]。还有研究发现，HIV-1TAT蛋白可以改变人足细胞的细胞骨架和肾素分布，直接增加肾小球通透性，这也可能是HIV阳性结核病患者尿液中LAM水平高的原因[45]。

尿液LAM测试是一种很便捷的检测方法，该测试可以直接在患者的床旁进行，并且只需要20 min。然而，HIV阴性的结核病患者尿液中的LAM浓度非常低，目前的检测对这类结核病患者的诊断仍不够敏感[46-48]。LAM具有抗原性，HIV阴性患者机体免疫功能正常，可引起强烈的体液免疫反应，此时LAM主要以循环免疫复合物的形式存在于循环中，不会轻易穿过肾小球基底膜，这可能是导致HIV阴性的结核病患者尿液中的LAM浓度低的原因之一。尿液中的LAM是否与抗体结合也很重要，当免疫功能正常时，机体会针对LAM产生相应抗体，进而形成免疫复合物，使LAM由于空间位阻难以进行免疫测定[45]。Flores等[49]研究指出，酶消化法更有利于显示LAM结构的末端，这有助于识别最佳表位以激活强大的免疫反应，从而获得更好的单克隆抗体，提高LAM诊断试验的敏感度和特异度。

(二)血液LAM检测的应用

几类体液中，外周血LAM检测可能成为尿液LAM的替代检查，但较尿液LAM，其敏感度更低。Jakhar等[50]研究表明，血液中LAM与宿主脂蛋白如高密度脂蛋白(high-density lipoproteins，HDL)有关，所以将LAM从宿主脂蛋白中分离可能有助于血液LAM的检测。但由于LAM-蛋白相互作用对其检测的干扰，以及检测的低敏感度，使血液LAM检测在结核病中的应用受到阻碍。

三、LAM的检测方法

(一)结核分枝杆菌LAM ELISA

2005年在坦桑尼亚首次进行了商业化结核分枝杆菌LAM ELISA试验，基于这项研究，标准化和商业化的LAM检测方法不断开发，如TB-LAM(Clearview)ELISA检测试剂盒、Determine TB-LAM(Alere)检测试剂盒及一种新型的快速侧流检测方法——Fujifilm SILVAMP TB LAM(SILVAMP-LAM)[51]。Determine TB-LAM(Alere)在价格上具有很大的优势，比核酸扩增检测低3～4倍，但敏感度较差[52]。在此基础上研制的SILVAMP-LAM是一种结合高亲和力单克隆抗LAM抗体的横向流动试验，其敏感度有一定的提升，但也不是很理想，敏感度更高的LAM检测方法仍在继续开发。CD4+T淋巴细胞计数会影响尿液LAM检测的敏感度，血液中LAM-HDL或LAM-蛋白质复合物的存在对血液LAM检测存在干扰。此外，LAM本身的两亲性性质，会使其黏附在ELISA塑料板孔和其他表面，降低分析的可靠性、敏感度和重现性[53]。

尽管尿液LAM检测的敏感度和特异度仍有待提高，基于ELISA的诊断方法的发展已为第一代LAM测试打开了大门[49]。然而，分析样本的基质效应、免疫抑制患者的低敏感度等技术局限还未得到突破，分枝杆菌负荷和LAM浓度之间的定量相关性也未得到进一步的研究，如果能克服这些技术局限和证实这种定量相关性，LAM检测可在结核病治疗监测和早期识别结核病复发中发挥更大作用。

(二)脂蛋白捕获和膜插入

在临床样本中，LAM的表位常被宿主脂蛋白隔离，必须将LAM从这种构象中释放或分离才能方便检测[53]。Jakhar 等[50]开发了脂蛋白捕获和膜插入两种检测水样中两亲性物质的方法，这两种方法都可以直接测定血清中的LAM，并且独立于宿主因素(膜插入)的检测方式比依赖于宿主因素(脂蛋白捕获)的检测方式更敏感。此外，他们也证明了使用波导平台比传统的基于塑料孔板的ELISA提高至少10倍的敏感度。这两种方法为提高LAM-ELISA试剂盒的检测性能提供了新的方向。

(三)ManLAM核酸适配体免疫组化

基于LAM的病理检查在结核病确诊中也起着重要作用。核酸适配体是一种单链寡核苷酸，可以折叠成特定的结构，与小的化学物质、糖、脂质、蛋白质或细胞等目标分子结合，它类似于抗体，具有易修饰、特异度高、亲和力强等优点[54]。Zhou等[55]使用基于ManLAM核酸适配体的免疫组化检测结核病患者、肺外结核患者及非结核病对照患者病变组织标本中的ManLAM，他们发现ManLAM核酸适配体免疫组化对肺结核和肺外结核的诊断具有较高的敏感度(86.38%)和特异度(92.86%)。这种方法诊断性能与IGRA和GeneXpert MTB/RIF相当，且样品制备简单、成本低，可直接测量病变组织中的结核分枝杆菌抗原，不依赖于宿主的免疫状态，对免疫缺陷或婴儿的结核病诊断更具有优势[56]。

总 结

结核病被认为是全球最严重的传染性疾病，其传染性强，死亡率高。LAM是结核分枝杆菌细胞壁的重要组成成分，具有重要而独特的免疫调节特性，可能作为活动性结核病和结核分枝杆菌潜伏感染诊断的标志物。尿液LAM测试是一种有用的床旁测试，可以很容易地与痰涂片和培养测试结合起来，作为辅助诊断结核分枝杆菌与HIV双重感染的有效方法。当患者尿液LAM检测结果呈阳性时，应积极进行抗结核治疗并持续监测整体情况。基于LAM的检测方法仍在不断开发，如脂蛋白捕获和膜插入及核酸适配体免疫组化，为LAM作为诊断结核病的生物标志物奠定了基础，但要使其更好地应用于临床诊疗，还有很长一段路要走。