核酸内切酶Surveyor酶切法快速检测MTB对吡嗪酰胺耐药性方法的建立及评估

胡严杰 龚世伟 任易

吡嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)作为常用的一线抗结核药品[1-2]，能在吡嗪酰胺酶(pyrazinamidase，PZase)的作用下生成吡嗪酸(pyrazinoic acid，POA)，中性条件下以POA-的形式存在，一部分POA-通过外排作用转运到细胞外，在酸性环境下，POA-被还原成不带电荷的POA分子。由于POA的动态平衡，不带电荷的分子再次被转运到细胞内，因为POA进入细胞时带一个质子，经过大量累积后使细胞质酸化，导致细菌死亡，从而发挥抗结核作用[3-5]。此外，PZA也可将治疗周期从9～12个月缩短至6个月[6]。因此，成为结核病短程化疗的基石。

PZase是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)的pncA(561 bp)基因编码的蛋白，PZase编码基因及其启动子序列的突变是造成PZase活性降低或缺失的主要原因[7-8]，也是PZA耐药的主要原因。PZase编码基因及其启动子序列的突变形式包括点突变、插入和缺失，可能发生突变的碱基几乎覆盖了整个基因，因此不便于应用常用的基于探针杂交的分子检测技术。Surveyor酶是植物中提取的核酸内切酶，它可特异性切割DNA错配部位，无特异酶切核苷酸序列，并已用于MTB乙胺丁醇耐药基因突变的检测[9]。本研究采用核酸内切酶Surveyor酶切法测定MTB对PZA耐药性，并与BACTEC MGIT 960法检测结果和基因测序结果进行对比，评估该方法的临床应用价值。

材料和方法

一、菌株来源

MTB标准菌株H37Rv(ATCC27294)、PZA耐药的MTB标准株BCG(ATCC 34540)，以及91株(选取106株，最终复苏成功91株)耐多药MTB菌株均来自武汉市肺科医院。

二、 PCR扩增

50 μl PCR扩增体系包括25 μl Taq Master Mix(2×)，5 μl模板分别来自H37Rv、BCG或91株耐多药MTB临床分离株，其中H37Rv扩增时上游引物∶下游引物分别为1∶1、5∶4、5∶3、5∶2；临床株扩增时上游引物∶下游引物分别为1∶1、4∶5、3∶5、2∶5，最后加dd H2O补足至50 μl。PCR扩增条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性45 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，扩增35个循环，最后72 ℃延伸10 min，PCR产物4 ℃保存备用。

三、 DNA杂交

PCR结束后将标准菌株H37Rv的扩增产物和临床分离株的扩增产物以1∶1的比例混合，95 ℃加热10 min后，以2 ℃/s降温至85 ℃，保持1 min。然后以0.3 ℃/s降温至25 ℃。每隔10 ℃保持1 min。

四、 Survey酶酶切法

取20 μl杂交混合液，加入1 μl的Surveyor Enhaner S、1 μl的Surveyor Nuclease S和2 μl的0.15 mol/L的MgCl2。混匀后42 ℃孵育1 h。取出后加入2.5 μl的终止液。

五、 BACTEC MGIT 960法检测MTB对PZA耐药性

使用BACTEC MGIT 960法检测PZA的耐药性，试剂由美国BD公司提供，并按照试剂盒说明书进行操作，其中接种0.5 ml菌悬液更改为0.25 ml，且PZA使用浓度为100 μg/ml。

六、 基因测序检测MTB对PZA耐药性

提取耐多药MTB临床分离菌株后进行PCR扩增，根据美国国家生物信息中心(NCBI)获取H37Rv的pcnA基因序列，设计并合成引物。上游：5′-GTCATGGACCCTATATCTGTGGCTGCCGC-GTCG-3′；下游：5′-TCAGGAGCTGCAAACCAA-CTCGACGCTGG-3′。50 μl PCR扩增体系包括25 μl Taq Master Mix(2×)，5 μl模板，2 μl上游引物，2 μl下游引物，16 μl dd H2O。PCR扩增条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性45 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，扩增30个循环，最后72 ℃延伸10 min，PCR产物4 ℃保存备用。取5 μl的扩增产物，经1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增是否成功，扩增产物送北京睿博兴科生物技术有限公司进行纯化及测序。从NCBI获取H37Rv的pncA基因的碱基序列，使用Clone Manager 8.0软件将所有的基因测序结果与标准基因碱基序列进行比对，找出突变位点及突变类型。

七、 统计学处理

采用SPSS 12.0软件进行统计学分析。计数资料采用百分比(%)表示。基因测序结果采用Clone Manager 8.0软件进行分析。

结 果

一、核酸内切酶Surveyor酶切法检测方法的建立

注 从左到右的加样顺序为：1～4孔为1∶1的H37Rv分别与2∶5、3∶5、4∶5、1∶1的BCG杂交后酶切，5～8孔为5∶4的H37Rv分别与BCG杂交后酶切，9～10、12～13孔为5∶3的H37Rv分别与BCG的杂交后酶切，14～17孔为5∶2的H37Rv分别与BCG的杂交后酶切，11孔为Marker，Marker条带大小自下而上分别为100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp图1 核酸内切酶Surveyor酶切法检测(引物配比摸索)电泳图

图1显示，第13和14孔的产物条带最亮，且区分度最高，其中第13孔是由5∶3(上游引物∶下游引物)H37Rv为模板的扩增产物与1∶1(上游引物∶下游引物)BCG临床株为模板的扩增产物杂交后的酶切条带，第14孔是由5∶2(上游引物∶下游引物)H37Rv为模板的产物与2∶5(上游引物∶下游引物)BCG为模板的产物杂交后的酶切条带。两者的杂交带和酶切产物带的亮度均较为接近，考虑到引物的使用，最终选择上游引物∶下游引物为5∶2 扩增H37Rv，选择上游引物∶下游引物为2∶5扩增临床耐多药MTB菌株来检测临床耐多药MTB菌株的PZA耐药性。

二、核酸内切酶Surveyor酶切法检测MTB对PZA的耐药性

当电泳图上的酶切孔只有1条电泳条带时判定其为野生型，即为敏感株；当电泳图上的酶切孔有≥2条电泳条带且与杂交孔条带对比不一致时判定为突变株，即为耐药株。如果电泳图出现酶切孔有>2条电泳条带且与杂交孔的条带一致，则视为无效结果，需要重做。H37Rv电泳酶切孔只有1条电泳条带，BCG杂交孔只有1条电泳条带，酶切孔有3条电泳条带，判定检测结果有效(图2，3)。

注 Marker条带大小自下而上分别为100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp(标准品为核酸内切酶Surveyor酶厂家提供)图2 MTB标准品杂交条带及酶切条带电泳图

注 从左至右1、3、5、7、11、13、15、17孔为酶切条带，2、4、6、8、12、14、16、18孔为相对应的杂交条带，9、19孔为Marker(10孔为无效孔，没有点样)，Marker条带大小自下而上分别为100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp。其中5、6孔为BCG，突变位点为168 bp处，7、8孔为H37Rv，10号孔为无效孔，1～2和3～4孔为突变菌株孔，突变位点分别为36 bp与488 bp处，13、14孔为无效结果孔，其余为无突变菌株孔图3 MTB临床株杂交条带及酶切条带电泳图

三、以BACTEC MGIT 960法为对照分析核酸内切酶Surveyor酶切法的检测效能

以BACTEC MGIT 960法为对照，核酸内切酶Surveyor酶切法检测91株耐多药MTB菌株对PZA耐药性的敏感度为100.0%(29/29)，特异度为87.1%(54/62)，准确度为91.2%(83/91)。

四、以基因测序结果为对照分析核酸内切酶Surveyor酶切法的检测效能

以基因测序结果为对照，核酸内切酶Surveyor酶切法检测91株耐多药MTB菌株pncA基因及其启动子序列突变的敏感度为100.0%(37/37)，特异度为100.0%(54/54)，准确度为100.0%(91/91)。37株MTB突变株中29株经BACTEC MGIT 960法检测为耐药株，耐药突变率为78.4%，54株野生株全部经BACTEC MGIT 960检测为敏感株。

讨 论

核酸内切酶Surveyor酶是一种特殊的核酸内切酶，它没有特异酶切位点，但它可特异性识别和切割DNA错配部位，因此核酸内切酶Surveyor酶切法不需要知道MTB的pncA及其启动子区域的突变位置和类型，即可完成对其突变情况的检测。而且该技术已经应用于其他疾病的基因突变检测中[10-11]，但在结核病检测方面应用较少。本研究以基因测序结果作为对照，共检测了91株耐多药MTB菌株的pncA基因及其启动子序列的突变情况，与基因测序结果相比，核酸内切酶Surveyor酶切法检测的敏感度、特异度及准确度均为100.0%，且其酶切条带大小与突变位置基本一致。张霞等[9]的研究显示，使用核酸内切酶Surveyor酶检测线粒体基因相关突变时能检测出使用基因测序检测时检测出的突变位点，还能检测出未知的突变位点；同时Shi等[12]使用核酸内切酶Surveyor酶法检测MTB对乙胺丁醇耐药相关基因的突变，其与基因测序相比的一致率也高达100%，本研究的结果与张霞等[9]、Shi等[12]的结果一致；同时本研究的突变位点控制在可知的范围内，因此，核酸内切酶Surveyor酶切法能够有效检测出MTB的pncA基因突变情况。核酸内切酶Surveyor酶切法与基因测序的一致率高达100%，可为MTB的pncA及其启动子序列突变检测提供新的思路。

此外，本研究以BACTEC MGIT 960法为对照，核酸内切酶Surveyor酶切法检测91株耐多药MTB菌株PZA耐药性的敏感度为100.0%，特异度为87.1%，准确度为91.2%。Shi等[12]使用核酸内切酶Surveyor酶切10株MTB临床分离株的pncA基因，并与该菌株的PZase活性进行比较，其敏感度、特异度及准确度分别为100.0%、66.7%及88.9%。本研究与其相比特异度差异较大，可能是因为Shi等[12]选择的菌株较少，且仅有2株敏感株。虽然本研究及Shi等的研究都获得了100%的敏感度，但BACTEC MGIT 960法判定的PZA耐药菌株中大约有90%左右的菌株发生了pncA及启动子序列的基因突变[13-14]，因此，本研究获得的100%敏感度与抽样误差有关。

本研究中37株MTB突变株检测出29株耐药株，耐药突变率为78.4%，54株野生株全部为敏感株。与Ramirez-Busby和Valafar[8]的Meta分析结果稍有不一致，可能与本研究选择的样本量较少有关。而37株MTB突变株中有8株为BACTEC MGIT 960液体培养法鉴定的敏感株，进一步说明了MTB对PZA耐药性与pncA基因的突变高度相关，同时还可能存在其他的MTB菌株对PZA耐药的机制[15]。此外，MTB菌株发生突变但不耐药的原因可能是因为pncA及其启动子序列的突变只引起了很低的PZase活性的降低，导致很低程度的PZA耐药。这种降低没有达到表型药物敏感性试验可检测出的程度，而且这种程度的耐药可能不会引起临床问题。

综上，核酸内切酶Surveyor酶切法检测MTB的pncA基因及其启动子序列突变的性能与基因测序高度一致。虽然核酸内切酶Surveyor酶切法具有快速、操作简便、价格低廉的特点，可以在没有基因测序条件的地区作为MTB对PZA耐药检测的备选方案。但该方法不能够判断结果中的突变类型，不能有效区分同义突变和错义突变，不能对该部分造成的假阳性结果进行有效的区分；同时本研究的标本量有限，结果还需要更多的标本验证。