CASQ2基因c.381C＞T突变致儿茶酚胺敏感性多形性室性心动过速的分子机制

李翠兰，袁越，刘文玲，胡大一

长 QT 综合征（LQTS）是一种心脏离子通道病，表现为心电图上QT 间期（QTc）延长，T 波异常，易产生尖端扭转型室性心动过速、心室颤动等恶性心律失常，进而可引起晕厥甚至心脏性猝死。目前已经报道的基因亚型至少有15 个[1]。儿茶酚胺敏感性多形性室性心动过速（CPVT）是另一种离子通道病，常表现为无器质性心脏病个体在交感神经兴奋状态下发生双向（bVT）或多形性室性心动过速（pVT），可发展为心室颤动，引起患者晕厥，甚至猝死。目前发现的致病基因主要有2 个：RyR2和CASQ2[2]。这两种疾病都是少见但严重的遗传性心律失常，是青少年发生晕厥、猝死的重要原因。LQTS 有不完全外显现象，有些患者QTc 并不延长或只是临界值，有时QTc 在正常范围或临界值但又伴有显著U波，暂且称之为长QTU（LQTU）综合征。已有报道LQTS7 型（亦称1 型Andersen-Tawil 综合征）[3-4]和某些CPVT 患者[5]心电图都可表现有显著U 波。当心电图特征不典型时临床上很难区分到底是LQTS还是CPVT。目前主要通过心电图特征、临床特点，并结合基因检测结果进行诊断及鉴别分型。本研究对2 个心电图上有显著U 波，首诊怀疑LQTU 综合征的家系进行了全外显子筛查以期找到致病基因突变并确诊分型及发病机制。

1 资料与方法

1.1 研究对象及临床资料的收集

筛查对象是2004～2005年来我院就诊的两个初诊为LQTU 综合征的家系L79 和L104。初步诊断的依据主要来自于临床特征，如交感神经兴奋相关的晕厥，心电图记录到QTc[或QU 间期（QUc）]延长及室性心动过速，无器质性心脏病。记录先证者及其父母和一级亲属的病史、心电图和家族史，包括12 导联静息心电图、24 h 动态心电图和运动试验等结果。基因筛查研究经医院伦理委员会批准，所有患者签署知情同意书。

1.2 标本处置方法

DNA 提取：在征得患者知情同意后，抽取患者及其父母或一级亲属的外周静脉血样2 ml，置于EDTA 抗凝管中。用全血基因组DNA 提取试剂盒提取DNA，并检测DNA 的浓度及纯度。

患者基因组DNA 全外显子测序：两个家系基因筛查分别在上海药明康德医学检验所和北京康旭医学检验所完成。取患者2 μg 基因组DNA，打断至200～300 bp，构建基因组DNA 文库。对基因组DNA文库进行人类全外显子捕获。对捕获序列进行二代测序、生物信息学分析及数据库注释，并按照美国医学遗传学与基因组学会（ACMG）指南对变异位点进行致病性分析。

1.3 Sanger 测序

对于检测到的疑似致病变异，采用软件对目标位点及所在外显子（Exon）上下游区域设计引物，对先证者及其家系成员进行突变检测和验证，应用软件进行突变致病性分析，并分析变异对蛋白结构和功能的影响，并根据家系患病情况对疑似致病性变异位点进行家系共分离分析。

1.4 微小基因（minigene）功能验证

这部分实验分两部分。设计分别涉及CASQ2Exon 2/3/4 编码区域和Exon 8/3/10 编码区域。

分别构建CASQ2（NM_001232.4:c.381C＞T）野生型minigene 质粒和CASQ2（NM_001232.4:c.381C＞T）突变型minigene 质粒，克隆载体：pEGFP-C1；克隆位点：XhoI/BamHI；插入序列信息：Exon 2+内含子（Intron）2（前后各保留1 K）+Exon 3+Intron 3+Exon 4或者（Exon 8 加右侧翼200 bp）+（Exon3 加左右侧翼200 bp）+（Exon10 加左侧翼200 bp）。

质粒构建方法：采用无缝克隆方式设计引物分别扩增对应Exon 2/3/4 和Exon 8/3/10 及部分相邻Intron 序列的正常人基因组DNA 和携 带CASQ2（NM_001232.4:c.381C＞T）突 变位点的人基因组DNA，分别获得3 个野生型目的片段和3 个突变型目的片段插入基因。有关Exon2/3/4 的引物信息如下：CASQ2-mini-AF/CAAGTCCGGACTCAGATCTCGAGCTTGTGGCC CAGGTCCTTGAACATAAAGC，CASQ2-mini-AR/GTCCAATTGCTGTCAGTGTTTGAAAATCAGAGG AGCGG；CASQ2-mini-BF/AACACTGACAGCAAT TGGACTAAATGCCAGCTTTGTTT，CASQ2-mini-BR/TAGCTTCCAACTCACTTCTGACCTTCCCTC;CASQ2-mini-CF/CAGAAGTGAGTTGGAAGCTA CATTTACCAA,CASQ2-mini-CR/AGTTATCTAG ATCCGGTGGATCCATTCTGAGTCCTCACTCTTG AAAAAGCCA。有关Exon 8/3/10 的引物信息如下：CASQ2-E8N-F/CAAGTCCGGACTCAGATCT CGAGGAAGATGATTTGAATGGGATC，CASQ2-E8N-R/ATTGGAAATAGTCCAGAATTTGTTCACAC CTTTTCTTCTCTTAGCCGTGTGC；CASQ2-E3N-F/TCTGGACTATTTCCAATTAAATG，CASQ2-E3N-R/CA TAGCATAATTCTAGGGTGGCTTAAAGATCAC；CASQ2-E10N-F/CCCTAGAATTATGCTATGTCATCTTTTATTTAA TGCTTATTTG，CASQ2-E10N-R/AGTTATCTAGATCCGGT GGATCCATCTGTGACATTCACCACCCCAATC。

将上述PCR 产物无缝克隆到pEGFP-C1 载体，分别命名为pEGFP-C1-CASQ2-W 和pEGFP-C1-CASQ2-M-c.381C＞T。用上述两种表达载体分别转染293T 细胞，并于48 h 后提取293T 细胞总RNA，通过反转录PCR（RT-PCR）联合琼脂糖凝胶电泳和DNA 测序技术，鉴定微小基因表达产物，阐明该CASQ2突变的致病机制。

2 结果

2.1 L79 家系研究结果

临床发现：先证者女性，31岁，5岁时首次发生晕厥，QTc 0.44～0.49 s,QUc 0.64 s。母亲QTc 0.51 s。曾被诊断为癫痫，9岁时诊断为LQTS。9～15岁期间发作晕厥3～4 次，15～28岁晕厥两次。近3年服用普萘洛尔（2.11 mg/kg）无晕厥。童年期心电图上有显著U 波，随着年龄增加U 波不再明显（图1A～1C）。父母、姐姐均无晕厥史。

图1 儿茶酚胺敏感性多形性室性心动过速患者的心电图U 波表现

基因检测结果（图2A）：该患者根据心电图特点可初步诊断为LQTS 1 型（LQT1）或者CPVT。曾用直接测序法发现先证者携带KCNQ1/c.921+1G＞T杂合突变，其母亲和姐姐亦为杂合携带[6]。全外显子基因筛查在先证者CASQ2基因上检测到c.381C＞T（p.Gly127=）纯合变异。在千人基因组数据库（1 000 Genome）、人类Exon组整合数据库等多个正常人数据库中均未见该变异。经家系Sanger 验证，其父母、姐姐均杂合携带，提示该变异分别来源于父母亲。CASQ2基因c.381C＞T 变异位点在人类基因突变数据库（HGMD）曾被报道与常染色体隐性遗传CPVT 2 型相关，根据ACMG指南，该突变位点评级为疑似致病性变异。患者临床表现与CPVT 2 型符合。结合临床信息，可以诊断此例先证者为CPVT 伴LQT1，其母亲、姐姐为LQT1 无症状者。

图2 家系图及CASQ2 基因测序图

2.2 L104 家系研究结果

临床情况：先证者（L104-01）女性，20岁，5岁首次晕厥。心电图上QTc 0.43～0.44 s，QUc 0.71 s（V1～3）,V2导联U 波显著，幅度达到0.2 V，U 波幅度随年龄增加而降低，形态也有所变化（图1D～1F）。首次晕厥期间心电图记录到短阵bVT 和pVT。24 h动态心电图记录到心率快时（124 次/min）QTc 可达0.52 s。现服用美西律（9.78 mg/kg）和普萘洛尔（1.96 mg/kg），随访至今15年无晕厥，但最近随访发现有频发室性早搏二联律出现。对患者24 h 动态心电图记录中的室性早搏和U 波偶联间期随机测量发现，室性早搏联律间期与U 波到达峰顶时间QUpeak 基本一致，提示室早可能起源于U 波。先证者的妹妹（L104-02）5岁首次晕厥发作，心电图上亦有显著U 波，且随年龄增加而降低（图1G～1I）。QTc 0.40 s，QUc 0.70 s。服用美西律（7.81 mg/kg）和普萘洛尔（1.25 mg/kg），至今7年无症状。父母心电图均正常。

全外显子基因检测结果：患者被初步诊断为LQTU 综合征，根据Zhang 等[4]关于ATS 基因型表型关系研究预测可能为LQTS7 型，但对KCNJ2基因筛查结果阴性（数据未提供）。全外显子基因筛查发现，先证者携带有CASQ2/c.381C＞T（p.Gly127=）纯合突变，妹妹亦携带此纯合突变，其父母均杂合携带（图2B）。结合患者临床表现，CASQ2/c.381C＞T（p.Gly127=）纯合突变可能是导致该家系这两例患者发病的原因。

2.3 CASQ2/c.381C＞T 的minigene 功能验证结果

c.381C＞T 变异位于3 号Exon 上，首先进行了包含Exon2/3/4 的minigene 验证实验。PCR 扩增正常组预期序列为421 bp（T 后序列为载体转录序列，第一个C和T之间的序列为目的基因Exon转录序列，第二个C 为突变位点处）：catggtcctgctggagttcgtgaccgc cgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtccggactcagatctcg agCttgtggcccaggtccttgaacataaagctataggctttgtgatggtggatgcc aagaaagaagccaagcttgccaagaaactgggttttgatgaagaaggaagcctg tatattcttaagggtgatcgcacaatagagtttgatggCgagtttgcagctgatgtct tggtggagttcctcttggatctaattgaagacccagtggagatcatcagcagcaaa ctggaagtccaagccttcgaacgcattgaagactacatcaaactcattggctttttca agagtgaggactcagaaTggatccaccggatctagataactgatcataatcagcc ata。

但是结果在野生型和突变型的样本均检测到了2 个条带（图3）。将野生型和突变型的2 个条带分别进行Sanger 测序，通过比对发现：（1）大条带结果示3 号Intron 上存在一个选择性剪接位点，使用该位点的转录版本，可使3 号Exon 序列增加54 bp，增加序列为：tgaagaaggaaatctcttgtttgaacatgtgtgtatgtgcgtg tggcatttcag。对野生型来讲，此时编码Exon 3 的序列结束在第420 位置，之后直接遇到TGA 终止密码子（图3A），而对于c.381C＞T 突变型来讲，突变导致编码序列380_420 段缺失，第379 位核苷酸直接连接这54 bp 核苷酸（图3B），在第438 位核苷酸之后遇到TGA 终止密码子。（2）小条带结果示c.381C＞T突变位点造成了3号Exon上380_420段41bp碱基缺失，缺失序列为：gTgagtttgcagctgatgtc ttggtggagttcctcttggat；由于这41 bp 的碱基缺失，第379 位核苷酸后直接连接4 号Exon（图3C、3D），导致编码序列在第384 个核苷酸之后提前产生终止密码子TGA，预测翻译产物为只包含128 个AA的截短蛋白。而野生型的3 号Exon 则以正常剪接顺序和4 号Exon 进行了连接，预测可产生399 个AA 的完整全长蛋白。汇总上述序列比对结果画出了剪接示意图见图3E。

图3 利用CASQ2 Exon 2/3/4 序列进行的微小基因技术验证结果

其次，假如3 号Exon 后面的Intron 上无选择性剪接位点，剪接情况是否如预期一样可以顺利形成Exon 之间的连接？为此，本研究又设计了Exon 3 前后分别为8 号和10 号Exon 序列的实验。PCR 扩增正常组预期序列为354 bp（G、T 之间的序列为目的基因Exon 转录序列，前后为载体转录序列，C 为突变位点处）：catggtcctgctggagttcgtgaccg ccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtccggactcagat ctcgagGaagatgatttgaatgggatccacattgtggcctttgcagagaaga gtgatccaggttttgatgaagaaggaagcctgtatattcttaagggtgatcgca caatagagtttgatggCgagtttgcagctgatgtcttggtggagttcctcttgga tctcgttgcctactgggagaagactttcaagattgacctattcaggccacaga ttggggtggtgaatgtcacagaTggatccaccggatctagataactgatcata atcagccata。结果在野生型和突变型的样本均检测到了单个条带（图4A～4B）。Sanger 测序比对发现，c.381C＞T 突变位点与预期一致，造成了3 号Exon 上380_420 段41 bp 碱基缺失（图4C），缺失序列为：gTgagtttgcagctgatgtcttggtggagttcctcttggat。

图4 利用CASQ2 Exon 8/3/10 序列进行的微小基因技术验证结果

3 讨论

本研究首次在2 个家系中的3例中国LQTU 患者中发现CASQ2/c.381C＞T（p.Gly127=）纯合突变可引起CPVT，并通过minigene 验证法证实这个位于Exon 编码序列内的同义突变c.381C＞T（p.Gly127=）发挥作用的机制，是通过形成新的剪接位点而引起码内跳读，最终提前产生终止密码子而产生截短蛋白。另外发现这些CPVT 患者表现为在心电图上QTc 偶有临界值延长，但以显著U 波为主，并有U波随年龄增加而幅度降低的现象。这些结果丰富了中国CPVT 患者的基因突变谱。

CPVT 是常发生在青少年中的一种原发性恶性心律失常，目前发现主要和编码雷诺丁受体（RyR2）和集钙蛋白（CASQ2）的基因突变有关。CASQ2 蛋白是肌浆网内主要的Ca2+储存蛋白，通过接头蛋白/三合蛋白铆定在RyR2 上，作为肌浆网内Ca2+缓冲剂和RyR2 对腔内Ca2+敏感性的调节器来调节钙瞬变恢复（Ca2+transient restitution）。CASQ2不同突变可通过上述几个环节形成舒张期钙渗漏[2,7]。已知与CPVT 有关的CASQ2突变有28 个，其中在中国CPVT 患者中发现7 个突变[8-10]。

Roux-Buisson等[11]报道，CASQ2/c.381C＞T+c.546delT 复合杂合突变可引起一家系内患者CPVT 症状。于是Roux-Buisson 等在CASQ2/c.381C＞T 所处的3 号Exon 前后各使用8 号和10 号Exon序列进行minigene功能验证，结果证实c.381C＞T（p.Gly127=）突变虽未引起编码氨基酸变化但其改变了3 号Exon 后面的生理性剪切位点并引入了一个新的剪切位点，致使其后40 个核苷酸缺失，并在第128 位置产生提前终止密码子（PTC）。该患者的CPVT 可 能 是CASQ2/c.381C＞T 和c.546delT 两 个 突变共同作用的结果。

为何Roux-Buisson 等在minigene 验证CASQ2/c.381C＞T 功能时选用Exon 8/10，而非前后顺序衔接的Exon 2/4？就此，本研究设计了使用Exon 2/3/4序列的minigene 验证实验。结果发现，在对照个体及CPVT 患者，除了Exon 3 后的正常剪接位点外，在Exon 3 后面的3 号Intron 上均存在另一个选择性剪接位点（图3），导致出现2 个条带。测序结果分析表明，正常人使用选择性剪切位点时生成140 个AA 的截短蛋白，而使用正常剪切位点时可生成399个AA 的完整全长蛋白。但携带CASQ2/c.381C＞T 纯合突变的患者不管使用正常剪切位点还是使用选择性剪切位点都生成截短蛋白（128 个AA 和146 个AA）。所以，CASQ2/c.381C＞T 突变携带者与正常人的差别可能不是通过这个选择性剪切位点造成的（反正都生成了截短蛋白，随后可能降解掉），而是在使用正常剪切位点时突变携带者产生截短蛋白，但正常人不会。接着本研究又设计了与文献一样使用Exon 8/3/10 序列的minigene 验证实验，均得到和文献[11]报道一致的结论，只是发现文献中作者由于计算错误，把缺失41 个核苷酸误报成了40 个。

Rizzi 等[12]在CASQ2-R33Q 纯合突变基因敲入小鼠模型的研究发现，该突变通过增加CASQ2-R33Q 的降解而降低CASQ2 蛋白含量，致肌浆网内钙含量降低，连接肿胀，CASQ2 突变蛋白之间的聚集受损。CASQ2 蛋白是肌浆网内主要的Ca2+储存蛋白，作为仅有1 个AA 改变的错义突变R33Q 尚且如此，而 c.381C＞T 的纯合突变可导致蛋白截短至不足原来长度的三分之一，故有理由推测这种变化可能会通过无义介导的mRNA 衰变（nonsense-mediated mRNA decay）或蛋白降解[11]而影响其作为肌浆网内Ca2+缓冲剂的功能，容易形成舒张期钙渗漏而触发心律失常。

既往有研究提示了CPVT 和U 波的关系。Aizawa 等[13]2006年在CPVT 患者身上观察到U 波电交替现象，以及长间歇后负向U 波可以短暂变成正向U 波。赵东生等[14]也发现，CPVT 患者静息状态下心电图常表现为右胸导联（V1～3）T 波切迹、双峰及U 波高大。2008年Viitasalo 等[15]发现，CPVT患者的最大U 波/T 波幅度比值为0.8±0.6，显著大于正常对照组的0.4±0.3，β 受体阻滞剂可以降低快速心率下的U 波幅度。这些研究支持CPVT 患者的U 波与延迟后除极（DAD）触发活动相关的假说。同时研究者还发现室性早搏的偶联间期与U 波的偶联间期几乎一致。与这些研究类似，本研究在3例CPVT 患者中发现在V2导联存在显著U 波，且U 波幅度有随年龄增加而逐渐降低甚至消失的现象。其中在1例患者观察到室性早搏联律间期与U 波到达峰顶时间QUpeak 高度一致，提示此例患者室性早搏可能起源于U 波。

本研究中的3例患者中，L79 单纯β 受体阻滞剂治疗，随访近3年无晕厥。另外2例姐妹俩均为β 受体阻滞剂和美西律联用，跟踪随访7～15年无晕厥。提示β 受体阻滞剂单独或联用美西律对控制这类CPVT 有效。长期效果还有待于跟踪随访研究证实。

基因筛查及minigene 验证实验结合家系临床表现最后可确诊这3例患者为CASQ2/c.381C＞T（p.Gly127=）纯合突变引起的2 型CPVT，L79 先证者同时伴有LQT1。CASQ2引起的CPVT 比较罕见，本研究提示c.381C＞T 可能是国人CASQ2基因的突变热点，对复杂表型的遗传性心律失常患者进行全外显子筛查可以快速定位基因突变，帮助确诊。

心原性猝死在中国人群的发生率为14.48/10万[16]，而诸如致死率较高的CPVT 在我国几个主要的儿童与成人心律失常中心的诊断病例均极少，说明绝大多数一线医生对其缺乏认识而可能导致误诊[17]。本研究结果为及早识别CPVT 的疾病特征、了解其发病机理、提高对CPVT 的早期诊断和干预并改善预后提供了证据。

本研究的局限性：CPVT 患者症状发作时在心电图上的典型表现是双向性或多形性室性心动过速，但其发病的突发性使得这个特征不容易被记录到，所以本研究中只获得了L104-01 患者的一段短阵双向及多形室速记录，另外2例患者没有室性心动过速记录，造成开始时的诊断困惑。另外，功能研究部分只进行了minigene 验证实验，下一步计划进行诱导多能干细胞（iPS）和转基因动物等全细胞水平研究，包括免疫印迹，以及细胞电生理学参数等方面的探索。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突