Ras 同源基因家族蛋白A/Rho 相关卷曲螺旋蛋白激酶抑制剂对冠状动脉微栓塞引起心肌损伤的预防作用

吴永辉，聂绍平，任凤学，刘超永

冠状动脉微栓塞（CME）是冠心病介入治疗中常见的并发症，容易导致冠状动脉“无复流”以及“慢血流”的现象出现，并伴随其心肌收缩障碍、炎症应激和微梗死的发生，危及患者生命[1]。目前尚无更好的技术与手段能量化CME 相关指标，因此给临床介入的医护工作者带来很大挑战。研究表明[2]心肌细胞的凋亡是CME 发生、发展的关键事件。Zhu 等[3]研究证明抑制心肌细胞的凋亡能明显改善CME 大鼠的心功能。Mao 等[4]研究表明抑制大鼠的线粒体膜电位的下降，能明显降低凋亡率，缓解CME 大鼠的心脏功能障碍以及结构损伤，但是就CME 时的心肌细胞的凋亡机制至今尚未阐明。Ras 同源基因家族蛋白A（RhoA）/Rho 相关卷曲螺旋蛋白激酶（ROCK）信号通路能够调控血管平滑肌细胞的收缩、细胞黏附、分化、增殖、迁移和凋亡[5]。研究表明[6]RhoA/ROCK 通路与心血管疾病的发病机制密切相关，诸如高血压、冠状动脉粥样硬化性心脏病等，抑制RhoA/ROCK 信号能治疗多种心血管疾病，但尚少见RhoA/ROCK 通路在CME 的作用机制的报道。本研究通过建立大鼠CME 模型，来探讨RhoA/ROCK 通路在CME 的作用机制，从而为临床上应用提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料、主要试剂及仪器

在2020年1月至2020年6月期间，本研究开展动物实验。8～10 周龄的SD 雄性大鼠，SPF 级，共计60 只，体重在200～220 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号SCXK（京）2016-0011；依照本院实验动物管理办法，室温下标准饲料、自由饮水、分笼（4 笼）适应性饲养一周后用于试验。本研究中所有动物实验操作均经本院实验动物管理伦理委员会批准（批准号：2019-032）。

RhoA/Rho 信号通路抑制剂Y-27632（美国Selleckchem 公司），麻醉剂、多聚甲醛（Sigma 公司），苏木素-伊红染色（HE）试剂盒、苏木素碱性品红苦味酸（HBFP）试剂盒、脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记（TUNEL）染色试剂盒（上海碧云天生物技术公司），BCA 蛋白浓度测定试剂盒、化学发光试剂盒（广东锐博生物科技技术股份有限公司），B 细胞淋巴瘤/白血病基因-2（Bcl-2）抗体、Bcl-2 相关X 蛋白（Bax）抗体、磷酸化RhoA（p-RhoA）、ROCK1、ROCK2 抗体、兔抗3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）以及山羊抗兔IgG（美国abcam公司），免疫印迹法（Western blot）试剂盒（德国Rebstock 公司），阳离子脂质荧光探针四氯四乙基苯并咪唑羰花青（JC-1）试剂盒（美国 Amresco 公司）。

荧光显微镜（日本尼康公司），Bio-rad 凝胶成像系统（Bio-rad 公司），-80℃深冷冰箱（德国维根斯公司），Leica RM2135组织切片机（德国Leica 公司）。

1.2 CME 大鼠模型的构建及分组

将60 只SD 的大鼠，随机分为3组，每组20 只：假手术组，模型组，抑制剂组（RhoA/ROCK 通路抑制剂Y-27632 预处理）；在造模手术前1 h 抑制剂组大鼠尾静脉注射Y-27632（5 mg/kg），其他组大鼠输注等量的生理盐水。

模型组、抑制剂组大鼠参照文献[7]的方法制备CME 模型，具体如下：将各组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，取仰卧位固定在无菌操作台上。将其与小动物呼吸机经喉气管插管法连接，待大鼠呼吸性征平稳后，在大鼠胸左缘肋间备皮开胸，逐层分开，至心脏和主动脉暴露，使用血管夹夹闭10 s升主动脉，同时使用小动物微量注射器从大鼠左心室心尖处向左心室内注入42 μm 微栓塞球（100 ml，约3 000 个，冻干粉，挪威Dyno 公司）以建立CME 大鼠模型。待大鼠心率正常后关胸，等其自主呼吸无障碍后拔出气管插管，术毕注射青霉素防止感染；假手术组左心室心尖处注入100 ml 生理盐水，其他操作均相同。

1.3 超声心动图检测各组大鼠的心功能

造模以后常规饲养，12 h 后结束实验，开始进行彩色多普勒超声心动图检测，腹腔注射2%异氟烷诱导麻醉后，仰卧位固定，彩色多普勒超声心动图检查各组大鼠的心脏功能。检测左心室舒张末期容积（LVEDV）、心排血量（CO）、左心室短轴缩短率（LVFS）及左心室射血分数（LVEF）。

1.4 HE、HBFP 染色观察各组大鼠心肌组织病理学改变

超声心动图检查完毕后，将大鼠麻醉处死，开胸取出心脏，剔除其心房及心脏周围组织，将90%的心室部分迅速以液氮封存转入深冷冰箱待测，10%的心室部分，制成切片，进行HE、HBFP 染色，光镜下记录图像，并采用Leica Qwin3.4 图像统计软件通过平面法测量坏死区域，大鼠的微梗死缺血面积等于坏死的切片面积与纵切片面积的百分比值。

1.5 TUNEL 染色检测各组大鼠心肌细胞的凋亡

从冰箱中取出10%大鼠心室组织，常规方法固定，冰冻切片，二甲苯浸洗两次，梯度酒精浸洗5 min，风干后3%双氧水-甲醇浸泡10 min，PBS漂洗3 次，每次3 min，然后4℃预冷乙醇上进行如下操作：0.1%TritonX-100、0.1%缓冲液处理2 min，PBS漂洗3次，每次3 min，加入TUNNEL反应混合液，加封口膜在暗湿盒中反应1 h，温度37℃，PBS 漂洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，荧光显微镜进行观察。

1.6 JC-1 法检测各组大鼠心肌细胞线粒体膜电位变化

取10%心肌组织，加入裂解液，超声裂解30 s，按照线粒体提取试剂盒在0～4℃下提取心脏组织线粒体，之后严格按照线粒体膜电位试剂盒操作，并使用Image-Pro P lus 6.0 软件分析图像，以红色荧光/绿色荧光强度的比值来表示心肌细胞的线粒体膜电位[8]。

1.7 Western blot 检测各组大鼠心肌组织中凋亡蛋白Bax、Bcl-2 以及与信号通路相关蛋白p-RhoA、ROCK1、ROCK2 的表达水平

从冰箱中取出10%大鼠心肌组织，采用常规方法提取总蛋白，经BCA 试剂盒测定蛋白浓度后，准确量取50 μg，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），结束后，将样品蛋白经湿转法转至PVDF 转膜上，加入10%脱脂奶粉封闭3 h，加入一抗（Bax、Bcl-2、p-RhoA、ROCK1、ROCK2）并且以（1:1 500）比例进行稀释，维持4℃过夜孵育，洗涤加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗孵育3 h，增强化学发光ELC 显色30 min，经曝光、显影、定影后，以GAPDH 为内参来表示蛋白的表达水平。

1.8 统计学方法

本研究中的实验采用SPSS 16.0 软件进行数据统计，采用Graphpad5.01 作图，获得实验数据中符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，两组间比较采用t检验，多组间的比较采用单因素方差分析，当P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 彩色多普勒超声心动图检测大鼠心功能的变化（图1A，图1B）

图1 三组超声心动图检测（1A）及各组大鼠的LVEF、FS、CO 及LVEDV 比较（1B）（x，n=20）

彩色多普勒超声心动图检测各组大鼠心功能结果：与假手术组相比，模型组和抑制剂组大鼠的LVEF[（81.35±1.86）% vs.（46.71±5.63）%vs.（65.05±2.68）%，P＜0.05]、CO[（0.23±0.026）L/min vs.（0.03±0.02）L/min vs.（0.14±0.03）L/min，P＜0.05]、FS[（57.64±1.29）% vs.（26.35±3.34）%vs.（42.07±1.28）%，P＜0.05]明显降低，LVEDV[（5.68±0.21）mm vs.（7.36±0.14）mm vs.（6.45±0.17）mm，P＜0.05]明显升高；与模型组相比，抑制剂组大鼠LVEF、CO、FS 明显升高，LVEDV 明显降低，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。

2.2 各组大鼠心肌组织病理学改变（图2A，2B）

图2 各组大鼠心肌组织病理学改变（2A）及各组大鼠缺血心肌面积比率（2B）

HE 染色结果显示，心肌细胞胞浆染成均匀的红色，胞核呈现蓝色。假手术组大鼠心肌细胞结构完整，清晰可辨，细胞整齐排列，动脉微血管无异常病变。模型组大鼠肌细胞排列紊乱，部分核膜破裂，消失，可见部分细胞胞膜缺失，动脉微血管中可见大量微栓塞球填充，大量炎性细胞浸润；抑制剂组大鼠心肌细胞较模型组排列规整，炎性细胞浸润明显减少，微栓塞球填充明显减少。

HBFP 染色结果显示，胞核呈现蓝色，正常心肌组织呈现黄色或黄棕色，缺血心肌呈现红色。假手术组大鼠心肌细胞未见明显的微梗死病灶，模型组、抑制剂组大鼠可见多处微梗死病灶，主要分布在左心室内膜层，微梗死病灶呈现明显的红色。统计结果显示：与假手术组相比，模型组和抑制剂组大鼠缺血心肌面积比率明显升 高[（0.00±0.00）% vs.（15.55±2.67）% vs.（8.72±2.49）%，P＜0.05]；与模型组相比，抑制剂组大鼠缺血心肌面积比率明显下降（P＜0.05），差异均有统计学意义。

2.3 各组大鼠心肌组织中的细胞凋亡（图3A、3B）

图3 缺口末端标记（TUNEL）染色检测各组心肌组织中的细胞凋亡（3A）及各组心肌细胞凋亡率（3B）

TUNEL 染色结果显示，正常心肌细胞核呈现淡蓝色，凋亡细胞核呈现棕黄色。假手术组大鼠心肌呈现均匀的淡蓝色，未见棕黄色细胞核，与假手术组相比，模型组和抑制剂组大鼠心肌棕黄色细胞的数量明显增多，心肌细胞凋亡率[（3.35±1.22）%vs.（76.87±6.95）% vs.（43.66±3.82）%，P＜0.05]明显升高，与模型组相比，抑制剂组大鼠心肌棕黄色细胞的数量明显减少，细胞凋亡率明显降低，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。

2.4 各组大鼠心肌组织中的凋亡相关蛋白的相对表达（图4A，4B）

图4 免疫印迹法检测Bcl-2 和Bax 的表达（4A）及各组Bax 及Bcl-2 的相对表达（4B）

Western blot 检测结果显示，与假手术组相比，模型组和抑制剂组大鼠心肌细胞中Bcl-2 的表达[（0.99±0.08）vs.（0.33±0.19）vs.（0.97±0.08），P＜0.05]明显降低，Bax的表达[（0.83±0.20）vs.（4.56±0.65）vs.（2.23±0.22），P＜0.05]明显升高，差异均有统计学意义；与模型组相比，抑制剂组大鼠心肌细胞中，Bcl-2 的表达明显升高，Bax 的表达明显降低（P均＜0.05），差异均有统计学意义。

2.5 JC-1 法各组大鼠心肌细胞的线粒体膜电位（图5A，5B）

图5 各组大鼠心肌细胞的线粒体膜电位（5A）及各组红色荧光及绿色荧光比值（5B）

染料JC-1 通过发射荧光从绿转变到红来展现线粒体的膜电位的变化，本研究中JC-1 染色结果，假手术组大鼠心肌细胞被JC-1 染色后呈现红色荧光，与假手术组相比，模型组和抑制剂组大鼠心肌细胞绿色荧光强度明显增强，红色荧光与绿色荧 光 比 值[（96.22±9.35）% vs.（31.63±10.90）%vs.（63.55±9.69）%，P＜0.05]明显下降；与模型组相比，抑制剂组大鼠心肌细胞绿色荧光强度明显减弱，红色荧光有所增强，红色荧光与绿色荧光比值明显上升，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。

2.6 Western blot 检测各组大鼠心肌组织中p-RhoA、ROCK1、ROCK2 蛋白的表达水平（图6A，6B）

图6 各组大鼠心肌组织p-RhoA、ROCK1、ROCK2 蛋白的表达（6A）及各组p-RhoA、ROCK1、ROCK2 蛋白的相对表达（6B）

Western blot 结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠心肌组织p-RhoA[（0.97±0.05）vs.（4.78±0.26），P＜0.05]、ROCK1[（0.98±0.08）vs.（4.28±0.23），P＜0.01]、ROCK2[（1.06±0.09）vs.（4.57±0.19），P＜0.05]蛋白的表达明显升高，差异均有统计学意义；与模型组相比，抑制剂组大鼠心肌组织p-RhoA[（4.78±0.26）vs.（2.11±0.13），P＜0.05]、ROCK1[（4.28±0.23）vs.（2.46±0.37），P＜0.05]、ROCK2[（4.57±0.19）vs.（2.29±0.11），P＜0.05]蛋白的表达明显下降，差异均有统计学意义。

3 讨论

急性冠状动脉综合征溶栓治疗或经皮冠状动脉介入治疗（PCI）过程中常伴有CME 的发生。CME 的出现常常造成患者心律失常、冠状动脉储备减少以及不可逆的心肌损伤，尤其是CME 中伴有的“无复流”、“慢血流”严重影响患者的心脏功能以及预后，甚至危及生命[9]。目前尚无有效的根治性治疗手段。研究表明[10]左心室心肌细胞异常凋亡是CME 发生的主要因素。因此研究CME 中左心室心肌细胞的凋亡机制对临床治疗具有重大意义。

心脏是能量消耗较高的器官，线粒体是细胞进行能量代谢的场所。研究表明[11]心脏能量代谢失常是心肌细胞凋亡的始动事件。线粒体膜电位的下降是心肌细胞早期凋亡的标志性事件。抗凋亡蛋白Bcl-2 与促凋亡蛋白Bax 的比值降低是启动线粒体凋亡途径的开关。Liu 等[12]研究报道CME 后心肌细胞Bcl-2 的表达减少，Bax 的表达增加，心肌细胞凋亡率升高。He 等[13]研究证实在对CME 大鼠进行抗细胞凋亡干预后，明显改善了大鼠的心功能以及减小其心脏发生微梗死的面积。Liang 等[14]研究证实改善CME 大鼠的线粒体功能，调控Bcl-2 与Bax的表达比值，提高其线粒体膜电位，恢复心肌细胞线粒体的能量代谢过程，能明显降低心肌细胞的凋亡率，CME 后的心肌的能量代谢障碍有助于心功能的恢复。本研究通过构建CME 模型发现，模型组大鼠心脏超声心动图明显观察到心功能下降，HE、HFBP 切片后可明显观察到心肌血管微栓塞以及心肌组织微梗死病灶，说明CME 造模成功。模型组大鼠心肌凋亡率明显升高、线粒体膜电位明显下降、抗凋亡蛋白Bcl-2 表达减少以及促凋亡蛋白Bax 表达增加，与既往研究结果相符。

RhoA/ROCK 通路是机体内重要的信号通路，Rho 是小分子G 蛋白的成员之一，常作为信号转导的分子开关，直接参与调控细胞形态维持、细胞粘附与迁移、平滑肌收缩等多种细胞生物效应[15]。ROCK 主要包括ROCK1 和ROCK2 两种亚型，是RhoA 下游最重要的效应器，具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性。研究表明[16]ROCK 的两种亚型在氨基酸序列的一致性为65%，在激酶结构域的相似性为92%，ROCK 在脑、肌肉以及心脏组织等组织中广泛存在，ROCK1 主要在维系心肌细胞骨架结构中发挥重要作用，ROCK2 则具有调控心肌细胞收缩、黏附与分裂的作用。Seccia 等[17]临床研究表明RhoA/ROCK 通路与冠状动脉的病变密切相关。实验数据证明[18]抑制RhoA/Rho 通路后，ROCK 的转录功能降低，能够明显抑制心肌细胞的凋亡，改善慢性心衰大鼠的左心室重构。Cui 等[19]研究证实对缺血再灌注大鼠进行法舒地尔（RhoA/ROCK 通路抑制剂）治疗后，其线粒体功能明显恢复，心脏的能量代谢和心功能明显改善。但尚未见RhoA/ROCK 通路在CME 的作用机制的报道。本研究中用RhoA/Rho 激酶信号通路抑制剂Y-27632 来观察RhoA/Rho 信号通路在CME 的作用。结果发现抑制剂组大鼠心功能明显好转，组织病理明显改善，心肌细胞的凋亡率明显降低，线粒体膜电位明显上升，Bcl-2 的表达增加，Bax 的表达减少，而western blot 结果表明与假手术组相比，模型组大鼠心肌中p-RhoA、ROCK1、ROCK2 水平出现明显的升高；与模型组相比，抑制剂组大鼠心肌中p-RhoA、ROCK1、ROCK2 水平出现明显的下降，表明CME 激活RhoA/ROCK 通路，抑制RhoA/ROCK 通路，能明显改善CME 大鼠症状。

综上所述，CME 激活RhoA/ROCK 通路，抑制RhoA/ROCK 通路能明显降低心肌的凋亡率，改善CME 大鼠心功能。但是就是否还有其他通路参与这一过程以及如何将RhoA/ROCK 通路的抑制作用应用到临床上的CME 治疗中还需要进一步研究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突