蓝光对小鼠血压及血管内皮功能影响的研究

唐名扬，冯健，欧登科，郎明健，韩乾国，邹文淑，刘朝晖，李霜

最新调查研究显示，2012～2015年我国成人高血压患病率为27.9%，且患病率呈逐渐升高趋势[1]。高血压发病机制复杂，与遗传因素、神经机制、精神及生活方式等多种因素有关，其中生活方式在高血压的发展中起主导作用[2-3]。Donneyong 等[4]研究表明，夏季时人体血压、心血管疾病发病率和死亡率均低于冬季，与阳光照射时间及强度密切相关。上述研究提示阳光照射可能对心血管疾病具有一定保护作用，但是具体机制尚不明确。

阳光主要由红外线和微波构成，其次为可见光和紫外线。目前对阳光生物效应的研究主要集中在紫外线上，但紫外线能够引起细胞内脂质、辅酶以及DNA 出现氧化损伤，从而导致癌症的发生[5-6]，最终阻碍了其在临床疾病中的应用和发展。与之相反，近年来对阳光中蓝光的研究显示出其对多种疾病具有潜在价值，使其成为阳光生物效应新的研究热点。Manuel 等[7]研究表明，模拟阳光中的可见蓝光对人体的照射后，能够通过将皮肤内一氧化氮（NO）代谢产物释放到循环血液中，从而改善血压、内皮功能和动脉僵硬度，提示蓝光存在调节血压的潜能。但是，蓝光调节血压及血管内皮功能的机制尚不明确，深入研究这一问题对高血压病的防控具有重要意义。因此，本研究在前期实验的基础上，使用血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）诱导小鼠血压升高为模型，旨在探索蓝光在小鼠血压调节中的作用及对血管内皮功能的影响，以期为高血压的预防及治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物:8 周龄SPF 级雄性C57BL6/J 野生型（WT）小鼠100 只，体重（25.44±3.22）g，健康状况良好，由成都达硕实验动物有限公司提供。于中国人民解放军西部战区总医院实验动物中心SPF 级动物房饲养2 周，饲料为SPF 级小鼠饲料，饮用灭菌水，恒温23℃～25℃，恒湿（55±5）%，日夜规律光照各12 h。

主要仪器及试剂：蓝光光源、对照光光源 [型号：HL-A-5730D34W-S1-08-HR3（LY），广州鸿利光电股份有限公司]；小鼠智能无创血压计（型号Softron BP-2010A,北京软隆生物技术有限公司）；微型渗透泵(美国Alzet 公司)；小鼠NO、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）及内皮素-1（ET-1）检测试剂盒（武汉默沙克公司）；-80℃超低温冰箱、-20℃低温冰柜、4℃冷藏冰箱（中国海尔公司）；超净工作台（中国富康净化仪器设备）；离心机（德国Eppendorf 公司）。

1.2 实验方法

动物实验分组：先取20 只WT 小鼠随机均分为对照光组（CL组）及蓝光组（BL组），每组各10 只，观察各组小鼠血压变化；另取WT 小鼠40 只，随机分为4组：对照光+假手术组（CLS组）、对照光+手术组（CLO组）、蓝光+假手术组（BLS组）及蓝光+手术组（BLO组），每组各10 只，手术组利用Ang Ⅱ微型渗透泵干预建立高血压小鼠，假手术组利用生理盐水干预，在手术后即刻开始使用对照光或蓝光照射，观察各种小鼠血压变化；为进一步研究蓝光对小鼠血压影响的内在机制，再取40 只WT小鼠，随机分为对照光+正常血压组（CLN组）、蓝光+正常血压组（BLN组）、对照光+高血压组（CLH组）及蓝光+高血压组（BLH组），利用Ang Ⅱ/生理盐水微型渗透泵建立各组模型小鼠，在高血压小鼠模型成功后开始使用对照光或蓝光照射，并观察各种小鼠血压变化。

高血压动物模型建立：小鼠称重后用异氟烷麻醉小鼠，固定于手术台上，将两肩胛骨间背部毛发剔除，并进行皮肤消毒，做0.5 cm 左右小切口，钝性分离皮下，埋入预制Ang Ⅱ或0.9% 生理盐水的微型渗透泵，缝合皮下及皮肤，Ang Ⅱ以400 ng/（kg·min）的速度连续灌注27 d。

尾夹法测定小鼠血压：采用Softron BP-2010A小鼠无创血压测定仪测定CL组及BL组在相应干预前、干预期间及干预后100 min 血压值，在干预60 min 内及干预停止后100 min 内分别间隔10 min及20 min 多次重复测量小鼠血压；CLS组、CLO组、BLS组及 BLO组小鼠于每日上午8 时进行30 min 蓝光及对照光照射，并于手术当天及术后前10 d 每天测量血压，此后间隔4 d 测量血压，直至术后27 d；CLN组、BLN组、CLH组及BLH组前10 d 每天检测小鼠血压，此后间隔2 d 测量血压，测定前在小鼠安静、清醒状态下将传感器套在小鼠尾部，通过充气、放气对尾动脉加压和释压的同时监测血流信号，得出尾动脉血压值，收缩压、舒张压连续测量3 次，取其平均值。

光房：对照光房与蓝光房长宽高均为3 m×4 m×3 m，房间内安装空调恒温23℃～25℃，小鼠置于鼠笼内，对照光房内置于对照光源，波长为592 nm，蓝光房内放置蓝光光源，蓝光波长为469 nm，两组灯光放置在离皮肤40～60 cm 之间的距离处，辐照度水平约为42 mW/cm2，6 h 以上强度变化＜10%，6 h以上温度变化＜10℃。

酶联免疫吸附测定（ELISA）检测NO 及eNOS 生成：收集各组血液标本，予以乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝静置15 min，1 000 g 离心15 min，收集上清，将样品与标准品加入96 孔板中，37℃温育30 min，洗板5 次，加入酶标试剂50 μl，37℃温育30 min，洗板5 次，加入显色液，37℃避光显色15 min，加入终止液50 μl，15 min 内450 nm 波长依序测量各孔吸光度（OD 值）并处理数据[8]。

ELISA 检测ET-1 生成：收集各组血液标本，予以EDTA 抗凝静置15 min，1 000 g 离心15 min，收集上清，标本用标本稀释液1：1 稀释后将样品与标准品加入96 孔板中，加入50 μl 的生物素标记的抗体，37℃温育1 h，洗板5 次，每孔加入50 μl 的亲和链酶素-辣根过氧化物酶（SA-HRP），37℃温育30 min，洗板5 次，每孔加入底物A、B 各50 μl，37℃避光显色15 min，加入终止液50 μl，15 min 内450 nm 波长依序测量各孔吸光度（OD 值）并处理数据[9]。

1.3 统计学分析方法

采用SPSS 16.0 及GraphPad Prism 6 软件进行统计分析。小鼠血压指标以均数±标准误（）表示；ET-1、eNOS、NO 指标使用均数±标准差（）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用重复测量方差分析，方差齐进一步两两比较采用SNK-q检验，方差不齐采用非参数检验，每组各时间点减去本身基线所得差值表示血压变化（Δ），用均数±标准误（）表示。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 蓝光对正常小鼠血压的影响（图1A、1B）

图1 蓝光对正常小鼠血压影响的变化值（n=10，）

CL组与BL组小鼠来自同一批次，血压基线一致，差异无统计学意义（P＞0.05）。BL组小鼠收缩压在蓝光开始照射时即有下降趋势，并在照射30 min时下降最显著，与CL组相比，BL组收缩压也降低（P＜0.05）。此后BL组小鼠收缩压随着蓝光继续照射呈上升趋势，照射60 min 时停止照射，在蓝光停止照射20 min 后回到基线值附近。BL组小鼠的舒张压在蓝光照射前、照射60 min 内以及停止照射100 min 均无明显变化（P均＞0.05），与CL组相比，各个时间点差异均无统计学意义（P均＞0.05）。CL组小鼠在进入前、暗室内40 min以及此后2 h的收缩压、舒张压均无明显变化，各时间点差异均无统计学意义（P均＞0.05）。

2.2 蓝光对Ang Ⅱ诱导过程中小鼠血压的影响

CLS组、CLO组、BLS组与BLO组小鼠来自同一批次，血压基线一致，差异均无统计学意义（P均＞0.05）。CLS组小鼠在蓝光照射27 d 内血压在基线值附近波动；BLS组小鼠于蓝光照射后第1 天至第7天血压在基线值附近波动，第7 天至第27 天血压始终处于基线值之下，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

CLO组小鼠在Ang Ⅱ泵入第2 天可见血压有升高趋势，随后血压逐渐升高，并在第7 天血压达到最高点。与CLS组比较，收缩压升高了（45.10±4.51）mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），舒张压升高了（53.60±3.10）mmHg（P均＜0.05），随后进入平台期，到第27 天血压仍维持较高水平且血压波动不明显（图2A、2B）。

图2 蓝光影响Ang Ⅱ诱导过程中小鼠血压的变化趋势（n=10，）

BLO组小鼠在Ang Ⅱ泵入后第2 天可见血压升高趋势，随后血压持续升高，并于第10 天到达平台期。与CLS组比较，收缩压升高了（37.70±4.14）mmHg，舒张压升高了（48.20±4.41）mmHg（P均＜0.05）；与CLO组相比，BLO组小鼠血压升高缓慢，血压升高幅度较低，收缩压相差（-9.10±4.31）mmHg，舒张压相差（-7.20±3.30）mmHg（P均＜0.05）；此后进入平台期，直到第27 天血压维持在较高水平且波动不明显（图2A、2B）。

2.3 蓝光对高血压小鼠血压的影响

予以Ang Ⅱ诱导形成高血压小鼠模型，CLH组小鼠血压始终维持在高水平，BLH组在蓝光干预的第5 天可见血压下降趋势，随后继续缓慢下降，并于第14 天血压降至最低，与CLH组比较，BLH组小鼠血压显著降低，收缩压相差（-7.50±5.41）mmHg，舒张压相差（-7.10±4.06）mmHg（P＜0.05），随后进入平台期，直到第24 天两组小鼠血压无明显波动（图3A，3B）。

图3 蓝光影响高血压小鼠血压的变化趋势（n=10，）

2.4 蓝光对高血压小鼠eNOS、ET-1及NO的影响（表1）

表1 各组小鼠蓝光照射前后血清中eNOS、ET-1、NO 的含量变化（）

表1 各组小鼠蓝光照射前后血清中eNOS、ET-1、NO 的含量变化（）

注：CLN组：对照光+正常血压组；BLN组：蓝光+正常血压组；CLH组：对照光+高血压组；BLH组：蓝光+高血压组；eNOS：内皮型一氧化氮合酶；ET-1：内皮素-1；NO：一氧化氮。与CLN组比较*P＜0.05；与CLH组比较ΔP＜0.05

高血压小鼠模型建立成功后按计划随机分组并干预，于蓝光照射第14 天分别测量各组小鼠血浆中eNOS、ET-1 及NO 的含量，与CLN组相比，CLH组和BLH组小鼠血清中eNOS 及NO 含量减少，ET-1 含量增加，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。与CLH组相比，BLH组血清中eNOS 及NO 含量明显升高，而ET-1 含量明显降低，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。

3 讨论

越来越多的研究表明，阳光照射与人类健康密切相关，阳光照射与人的全因死亡率呈反比[10-11]。心血管疾病领域众多研究[4]表明，人体血压在夏季持续低于冬季，心血管死亡率及发病率于冬季时最高，同时与阳光照射时间呈负相关；Manuel 等[7]发现，对健康成年人进行全身蓝光30 min 照射后，能够明显降低人体收缩压。我们的研究发现，健康小鼠经469 nm 蓝光照射后，收缩压呈持续下降趋势，于蓝光照射30 min 时下降最明显，当继续进行蓝光照射时，收缩压变化不明显并有升高的趋势，在停止蓝光照射后，小鼠收缩压逐渐升高到基线附近，而小鼠舒张压在整个蓝光照射中波动不明显。以上数据说明正常血压小鼠经蓝光短时间（30 min）照射能够使收缩压明显降低，这为我们探索蓝光对高血压小鼠血压的影响提供了研究基础。

为进一步探究蓝光是否可以预防小鼠高血压的形成，我们使用Ang Ⅱ诱导小鼠血压升高，对小鼠进行Ang Ⅱ干预的同时，给予每日固定时间（8：00）30 min 蓝光照射，结果发现，与CLO组小鼠比较，BLO组小鼠血压升高的速率减慢，到达平台期的时间延长，且血压升高的程度较低，说明蓝光能够延缓并减轻Ang Ⅱ诱导过程中导致的小鼠血压升高。接着，我们研究了蓝光对高血压小鼠血压的影响，用Ang Ⅱ诱导形成高血压小鼠模型，并给予每日固定时间（8：00）30 min 蓝光照射，结果显示，高血压小鼠于蓝光照射后第5 天血压呈现下降趋势，并于第14 天血压下降最显著，说明蓝光能够降低高血压小鼠的血压。

既往Opländer 等[12]研究表明，蓝光照射能够增加人体皮肤中游离NO 的水平，并能够使增加的NO 从皮肤表面转移到皮肤下面的组织中，从而增加健康受试者局部皮肤的血流量；Manuel 等[7]发现，全身蓝光照射可以分解皮肤中对光不稳定的氮氧化物，释放NO 进入循环血液，从而降低大动脉僵硬度，并且能够通过使阻止动脉扩张来降低收缩压。为进一步明确蓝光对小鼠血压影响的内在机制，我们检测了高血压小鼠开始照射蓝光前及照射蓝光后第14天时血浆中eNOS 和NO 的含量，结果发现高血压小鼠经每日固定时间（8：00）蓝光照射30 min，干预14 d 后，血液中eNOS 及NO 的含量显著增加；同时我们还检测了小鼠体内缩血管物质ET-1 的含量，我们发现高血压小鼠经每日固定时间（8：00）蓝光照射30 min，14 d 后，血液中ET-1 的含量显著降低。

血管内皮功能障碍是高血压形成的主要原因，内皮依赖性收缩功能增强与内皮依赖性舒张功能减弱是其主要表现。在病理条件下，内皮合成缩血管物质ET-1 产生增多，舒血管物质NO 产生减少，从而引起血管剧烈收缩，导致高血压的形成，故NO 与ET-1 是衡量血管内皮功能的重要指标[13-14]。我们发现，蓝光有助于维持高血压小鼠体内NO/ET-1 的平衡，说明蓝光可以改善高血压小鼠的血管内皮功能。

近期，Ortiz 等[15]研究表明，蓝光通过调节人体昼夜节律改善轻度颅脑外伤患者预后；Killgore 等[16]探索发现，短波（450 nm）蓝光可以通过非视觉G 蛋白偶联受体黑素介导大鼠肺血管扩张;Bartman 等[17]阐明了在缺血及再灌注损伤中，蓝光能够通过增强糖酵解减轻心肌梗死面积，提高心功能。因此，我们推测：蓝光对小鼠血压及内皮功能的调节可能是通过调节昼夜节律或通过皮肤NO 途径实现的，具体机制将在下一步研究中论证。

总之，我们发现，正常小鼠接受30 min 蓝光照射能够使其收缩压下降；长期每日蓝光照射能够延缓Ang Ⅱ诱导小鼠形成高血压、降低血压升高的程度；高血压小鼠接受每日蓝光照射后血压显著下降，同时改善高血压小鼠血管内皮功能，这为蓝光在高血压防控方面提供了一定的研究基础和理论依据。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突