血清sPD-1和sPD-L1对类风湿关节炎的诊断价值及其与疾病活动度的相关性*

秦龙燕, 罗英亮, 刘俊, 李培霆, 蒙富雪， 曾家顺, 李龙*

(1.贵州医科大学附属医院 风湿免疫科， 贵州 贵阳 550004； 2.贵州医科大学第三附属医院 医学实验中心， 贵州 都匀 558000)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以外周多关节受累为主的、对称性、侵袭性、持续进展性炎症为特征的自身免疫性疾病，患者逐渐出现关节软骨及骨的破坏、导致关节畸形及功能丧失，致残率高[1-2]，所以早发现、早诊断及早治疗显得尤为重要。研究表明类风湿因子(rheumatoid factor，RF)与抗环瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide，CCP)抗体对RA诊断敏感度和特异度较高，已被临床广泛应用[3-4]。但是早期RA首发症状可以仅仅是单纯关节炎，但血清RF和抗CCP抗体没有改变，因此漏诊及误诊率较高[5]。程序性死亡受体1(programmed cell death-1，PD-1)及其程序性死亡配体1(programmed cell death-1 ligand 1，PD-L1)是新近发现的免疫球蛋白B7/分化抗原28(cluster of differentiation 28，CD28)家族成员，其可溶性形式[可溶性PD-1(soluble PD-1，sPD-1)]可通过与细胞膜表面PD-L1特异性结合后阻断PD-1/PD-L1通路负性信号的转导，导致T细胞活性增强，引起免疫调控失衡，从而导致RA[6]。可溶性程序性死亡配体1(soluble programmed cell death-1 ligand 1，sPD-L1)可与细胞表面的PD-1结合，产生负性信号，抑制T细胞活化增殖[7]。sPD-1、sPD-L1作为负性协同信号分子，可以引起T细胞激活和扩增、引起机体免疫紊乱导致RA[8]。有研究表明，sPD-1、sPD-L1在RA患者血清中升高[9]，但是其升高对RA的诊断价值及与疾病活动程度是否相关尚未有报道。为了提高RA诊断率，本研究探讨了sPD-1、sPD-L1在诊断RA方面的价值及与疾病活动度的关系，现将结果汇报如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2018年12月—2019年12月RA患者100例，RA诊断符合2010年美国类风湿学会(American College of Rheumatology，ACR)/欧洲抗风湿联盟(The European League Against Rheumatism，EULAR)标准[3]，排除系统性红斑狼疮、干燥综合症及重症肌无力等其他自身免疫性疾病，排除并发感染、恶性肿瘤、心脑血管疾病等其他系统疾病或全身衰竭者及其他可能影响生存质量的疾病的患者。根据RA疾病活动评分(disease activity score 28-3，DAS28-3)[10]将100例RA患者分为缓解期组(n=50，DAS28-3<2.6分)和活动期组(n=50，DAS28-3≥2.6分)，缓解期组RA患者男16例、女34例，年龄28～64岁、平均(48.2±8.4)岁；活动期组组RA患者男14例、女36例，年龄27～91岁、平均(53.4±13.7)岁。同时选取体检中心健康体检者50例作为正常对照组，男17例、女33例，年龄24～84岁、平均(49.4±18.7)岁。本研究获医院伦理委员会批准(2018H001)及被检者知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1血样采集 分别采集2组RA患者入院次日、正常对照组受检者体检当日空腹外周静脉血各8 mL，取2 mL注入EDTA抗凝管、2 mL注入枸橼酸钠抗凝血沉管及4 mL注入分离胶促凝管中，将促凝管中样本以3 000 r/min离心20 min，收集血清1～2 mL。

1.2.2酶联免疫法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测血清sPD-1及sPD-L1表达 使用sPD-1和sPD-L1酶联免疫分析试剂盒(上海江莱)，设置标准品孔和样本孔及空白孔，取标准品50 μL依次加入微孔，样本孔中加待测样本50 μL，空白孔加样本稀释液50 μL；空白孔、标准品孔和样本孔中加辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的检测抗体100 μL/孔，封板膜封住反应孔，37 ℃恒温箱(上海助蓝)温育60 min；自动洗板机(山东博科)洗板，加洗涤液350 μL/孔，静置1 min，重复洗板5次；先加底物A(含过氧化氢) 50 μL/孔，再加底物B(含3，3′，5，5′-Tetramethylbenzidine,TMB )50 μL/孔 ，37 ℃避光孵育15 min；加终止液50 μL/孔终止反应，30 min内进行比色，以空白孔调零，酶标仪(北京天石)450 nm 波长依序测量各孔的吸光度(optical delnsity，OD)。

1.2.3全自动血液细胞分析仪(深圳迈瑞)检测白细胞(white blood cell，WBC) 将3组受试者全血试管放入仪器，计数界面选择自动全血模式进行WBC计数。

1.2.4全自动血沉分析仪(意大利Diedde,Ves-matic 20)检测血沉(erythrocyte sedimentation rate，ESR) 3组受试者采血后将血沉管中全血上下颠倒混匀7～10次,使枸橼酸钠抗凝剂与血液充分混匀，将血沉管放入仪器中测得血沉值。

1.2.5全自动生化分析仪(美国贝克曼库尔特，AU5800)检测类风湿因子(rheumatoid factor，RF)、谷丙转氨酶(alanine transaminase，ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase，AST)、血清肌酐(serum creatinine，SCr)、C反应蛋白(c-reactive protein，CRP) 将3组受试者血清样本放入仪器中，选择免疫散射比浊法测定RF，采用速率法检测ALT、AST及SCr，采用比浊沉淀法检测CRP。

1.2.6全自动电化学发光分析仪(德国罗氏，e601型)检测血清抗环瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide，CCP)抗体 采用电化学发光法检测3组受试者血清CCP抗体。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 一般资料分析

结果显示，正常对照组、缓解期组及活动期组受试者的性别、年龄、WBC、ALT、AST及SCr等指标比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组受检者一般资料Tab.1 General information of all groups

2.2 血清sPD-1和sPD-L1水平

结果显示，活动期组受试者血清sPD-1水平分别高于缓解期组和正常对照组，且缓解期组受试者高于正常对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；3组受试者血清sPD-L1水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组受检者血清sPD-1和sPD-L1水平[M(P25～P75)]Tab.2 Levels of serum sPD-1 and sPD-L1 in all groups[M(P25～P75)]

2.3 RA患者血清sPD-1与ESR、CRP、DAS28-3的相关性

散点图结果显示，RA患者血清sPD-1与ESR、CRP、DAS28-3呈线性关系；Pearson相关分析结果显示，RA患者血清sPD-1与ESR(r=0.743，P<0.001)、CRP(r=0.672，P<0.001)、DAS28-3评分(r=0.946，P<0.001)均呈正相关。见图1。

图1 RA患者血清sPD-1与ESR、CRP、DAS28-3的相关性Fig.1 Correlation between sPD-1 and ESR, CRP, DAS28-3 in RA patients

2.4 RA患者血清sPD-L1与ESR、CRP、DAS28-3的相关性

散点图结果显示，RA患者血清sPD-L1与ESR、CRP、DAS28-3无线性相关。见图2。

图2 RA患者血清sPD-L1与血沉ESR、CRP、DAS28-3的相关性Fig.2 Correlation between sPD-L1 and ESR, CRP, DAS28-3 in RA patients

2.5 抗CCP抗体、RF及sPD-1对RA的诊断价值

ROC曲线结果显示，抗CCP抗体、RF及sPD-1对RA诊断价值以sPD-1的AUC最大，即诊断价值最优，最佳截断值为305.56 μg/L；RF、sPD-1分别与抗CCP抗体的AUC比较，差异均有统计学意义(P<0.001)。见表3和图3。

图3 抗 CCP 抗体、RF及sPD-1诊断RA的ROC曲线Fig.3 ROC curve of anti-CCP antibody, RF, and sPD-1 in the diagnosis of RA

表3 抗CCP抗体、RF、sPD-1对RA的诊断价值Tab.3 Analysis of the diagnostic value of anti-CCP antibodies, RF, sPD-1 for RA

2.6 抗CCP抗体、RF及sPD-1对RA病情活动度的预测价值

ROC曲线结果显示，抗CCP抗体、RF及sPD-1预测RA病情活动度的AUC分别为0.952、0.854及0.974，其中sPD-1对RA疾病活动度预测价值最大，最佳截断值为370.75 μg/L；抗CCP抗体、sPD-1分别与RF的AUC比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4和图4。

图4 抗CCP抗体、RF及sPD-1预测RA病情活动度的ROC曲线Fig.4 ROC curve of anti-CCP antibody, RF, and sPD-1 on predicting RA disease activity

表4 抗CCP抗体、RF、sPD-1对RA病情活动度的预测价值Tab.4 Predictive value of anti-CCP antibodies, RF, and sPD-1 on RA disease activity

3 讨论

RA是一种慢性自身免疫性疾病，全球患病率为0.18%～1.07%，我国患病率为0.4%，是我国最为常见的风湿病之一[11-12]。RA不仅侵犯外周关节最终使关节结构破坏、畸形及功能丧失，而且也可导致心肺、神经及血液系统等组织器官受累[13-15]。目前，诊断RA是结合临床表现、类风湿因子、抗CCP抗体及影像学等多项指标综合判断[16]。磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)可以观察到早期的RA关节改变，但由于MRI成本较高、常规使用受到限制，成本相对较低的血清学检测因此得到广泛应用[17]。RF、抗CCP抗体虽然有助于RA的诊断，但临床上往往存在很多RF及抗CCP抗体阴性但明确诊断为RA的患者，且二者对RA疾病活动度没有很好的判断作用，观察病情活动还需要结合28个关节疼痛、肿胀情况及血沉等指标计算疾病活动评分(disease activity score 28，DAS28)作为评估指标，过程较为复杂[10]。所以寻找新的、可靠的实验室检测指标来补充RA血清学诊断很有必要。因此本研究旨在探讨血清sPD-1、sPD-L1水平是否可作为RA的辅助诊断指标以及其与RA疾病活动度的相关性。

负性协同信号分子可以抑制细胞的活化和增殖，sPD-1、sPD-L1作为天然存在的膜型PD-1/PD-L1的调节因子，可参与调节机体病理、生理状态下的复杂免疫反应[18-20]。有研究证实，sPD-1、sPD-L1是反映RA疾病活性的有用标志物[21]。先前的一些研究表明，RA患者的血清sPD-1表达水平升高可能与患者肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平增加相关，且sPD-1作为PD-1的可溶性形态，被认为是PD-1/PD-L1通路的拮抗剂，可以功能性阻断并抑制膜结合的PD1对T细胞活化的免疫调节作用，减弱PD-1途径，并通过限制T细胞受体的诱导，抑制PD-1的活化从而导致疾病恶化[9,22]。本研究中RA患者血清sPD-1比正常对照组升高(P<0.05)，说明血清sPD-1在RA患病机制中起到了一定的作用，可能是帮助RA疾病诊断的指标或免疫治疗的生物标志物及靶点。此外，活动期组RA患者血清sPD-1水平高于缓解期组(P<0.05)，提示其可能与病情的活动、发展及转归有关；同时其与ESR、CRP、DAS28-3评分等RA病情活动相关指标均呈正相关，表明血清sPD-1对RA患者的疾病活动程度有一定的预测价值，进一步提示了sPD-1可作为预测疾病发展的参考指标。另一方面，有研究表明：sPD-1、sPD-L1是一对作用相反的调节因子，可通过动态平衡参与机体免疫调控[23]。严琦[24]研究发现sPD-L1可与膜型sPD-1结合，使细胞周期停留在G0/G1期，产生负性信号，抑制细胞增殖活化。本研究中，3组受试者血清sPD-L1水平无差异，且sPD-L1与ESR、CRP、DAS28-3评分均无相关性，这与严琦[24]研究结果一致，但与Yanxia等[9]结果不一致，可能是RA患者血清sPD-L1的低水平表达不足以激活PD-1/PD-L1抑制信号通路，使T细胞过度活化、细胞因子产生，自我耐受破坏，最终致免疫疾病的发生；也可能是与研究样本量较小有关。

目前大部分实验室对抗CCP抗体、RF应用较多，这2个指标被广泛应用于RA的诊断，且有明确的诊断界值[25]。然而仍有部分早期患病人群和疑诊患者抗CCP抗体和RF均为阴性，根据本研究结果推测，sPD-1的检测可以补充RA血清学诊断学的不足。通过对RA病例的血清sPD-1水平分析，证实了sPD-1在疾病诊断中的应用价值。ROC曲线结果表明，sPD-1的AUC高于抗CCP抗体及RF，对RA诊断价值最优，且当血清sPD-1>305.56 μg/L时，患者发生RA的可能性较高，这个结果为临床医生提供一个新的参考指标。因此再进一步探测sPD-1与疾病活动度的预测价值，本研究结果显示抗CCP抗体、RF、sPD-1预测RA病情活动程度时，sPD-1预测RA病情活动程度时AUC最大，表明sPD-1对评估RA患者病情缓解或是活动的预测价值优于抗CCP抗体及RF，同时ROC曲线显示，当sPD-1>370.75 μg/L,时，疾病活动的可能性较大，可让临床医生为患者制定合理化治疗方案提供依据。

本研究表明，抗CCP抗体、RF、sPD-1诊断RA的ROC曲线对比时，RF与sPD-1的AUC比较、差异无统计学意义(P>0.05)，但是sPD-1的特异度高于RF，综合来说sPD-1诊断价值效果可能优于RF；当sPD-1用于预测疾病活动程度时，抗CCP抗体与sPD-1的AUC比较、差异无统计学意义(P>0.05)，考虑到sPD-1的AUC最大，且sPD-1、抗CCP抗体的灵敏度和特异度差异不大，由此推测检测血清sPD-1用于预测疾病活动程度是可行的。故综合诊断和疾病活动度两个方面考虑，检测血清sPD-1帮助诊断RA与预测疾病活动程度的综合价值优于抗CCP抗体及RF。但本研究样本量有限，未来还需要做进一步研究来验证这一发现，也需要一个特定的临界值帮助决定治疗方案，这有助于早期血清抗CCP抗体及RF阴性的患者发现并评估病情。

综上所述，血清sPD-1水平在RA患者中升高，且与疾病活动指标相关，在诊断及预测RA疾病活动度时有一定的价值。因此，sPD-1可作为一种新的RA血清学辅助诊断指标及预测病情活动的评估指标，从而为临床医生决定是否对早期血清学阴性的RA患者进行抗风湿治疗提供帮助，但血清sPD-L1能否作为评估RA患者病情变化的指标有待于进一步研究。