胃癌组织中α肌动蛋白4表达及其对胃癌AGS细胞迁移的影响*

杜洪， 夏英， 金泳， 韦四喜,， 夏万松， 李红羽， 袁婷， 黄海*

(1.贵州医科大学附属医院 临床检验中心， 贵州 贵阳 550004; 2.贵州医科大学 医学检验学院， 贵州 贵阳 550004； 3.贵州中医药大学第一附属医院 检验科， 贵州 贵阳 550001)

胃癌(gastric cancer, GC)是全球高发肿瘤之一，2020年全球癌症统计报告显示GC发病率为5.6%、排第5位，死亡率为7.7%、排第4位[1]。我国GC发病率居亚洲首位，也是我国仅次肺癌的第2大高发肿瘤[2-4]。GC的侵袭和迁移往往伴随着患者病情的恶化，同时也是GC患者生存率低、预后较差的主要原因之一[5-6]。因此，寻找介导GC发生发展的关键因素，并确定其作为新的预后生物标志物或治疗靶点成为当务之急。α肌动蛋白4(actinin alpha 4，ACTN4)定位于人染色19q13.2，基因跨度38647649～38731589，可通过与丝状肌动蛋白(actin-filament，F-actin)相互作用从而维持细胞骨架的完整性并调控细胞运动[7]。有研究报道，ACTN4与肺癌、乳腺癌等肿瘤的发生、发展及侵袭转移密切相关[8-13]，认为ACTN4可通过上皮间质转化而促进GC细胞的转移，有促癌作用[14]，但机制尚不清楚。因此，本研究通过生物信息学分析GC中ACTN4基因的表达和意义，并对ACTN4进行GC细胞系及组织验证，检测ACTN4敲低对GC细胞迁移的影响，为研究ACTN4在GC发生发展、转移中的作用和机制提供线索，现将结果汇报如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1细胞系和组织来源 GC细胞系AGS、MKN45、HGC-27、MGC803及正常胃黏膜细胞系GES-1购自中国科学院细胞库，293T细胞由上海交通大学金卫林教授实验室惠赠。选取胃肠外科手术20例GC患者GC组织，同时取相邻癌组织间隔5 cm以上癌旁组织作为对照；患者男13例、女7例，年龄38～85岁、平均(61.15±13.43)岁；组织标本均有唯一识别标记，留存于液氮中；本研究获得医院伦理道德委员会授权批准(2020伦审第106号)。

1.1.2主要试剂和仪器 UNlQ-10 柱式Trizol总RNA抽提试剂盒(上海生工生物)，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)试剂盒和TB Green®Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus,日本Takara)，聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量试剂盒和高效蛋白裂解液(radio immunoprecipitation assay，RIPA；北京索莱宝)，慢病毒包装质粒(中山大学孙逸仙纪念医院赠予)；LightCycler480荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)仪(瑞士罗氏)，凝胶成像分析仪(美国BIO-RAD)，台式冷冻离心机和普通PCR仪(美国Thermo Fisher)，倒置显微镜(日本NIKON)。

1.2 研究方法

1.2.1细胞培养 GC细胞系AGS、MKN45、HGC-27、MGC-803及正常胃黏膜细胞系GES-1细胞系生长于含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素抗生素的RPMI-1640培养基中，293T生长于含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素抗生素的DMEM培养基中，细胞系置于含5%CO2、37 ℃恒温恒湿培养箱培养。

1.2.2生物信息学分析 亚拉巴马大学癌症数据库(university of alabama cancer database，UALCAN)网站[15]分析癌症基因组图谱(the cancer genome atlas，TCGA)数据库ACTN4相关基因的差异表达，同时数据库分析ACTN4与GC淋巴结转移和分期之间的相关性。

1.2.3RNA的提取及定量PCR UNlQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒提取细胞和组织总RNA，并使用Nanodrop 2000进行定量及纯度测定，所提取RNA保存于-80 ℃。cDNA第一链合成用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒，保存于-20 ℃。TB Green®Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)用于定量分析，荧光定量PCR仪反应扩增，以HPRT基因为内参，ACTN4基因扩增引物为ACTN4-F:5′-TGGAGGTCATATCAGGGGAGC-3′，ACTN4-R:5′-GAGACCAGCTTGACGCCTTT-3′， 采用荧光定量PCR技术(real-time quantitative PCR，qRT-PCR) 检测正常胃黏膜细胞系GES-1，GC细胞系AGS、MKN45、HGC-27、MGC803及20对GC组织和癌旁组织中ACTN4基因的表达量。

1.2.4ACTN4慢病毒敲低模型的构建 将公司合成的短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)质粒、慢病毒包装质粒进行扩增。准备293T细胞，包病毒前1天更换新鲜无双抗的培养基，配制转染体系：opti-MEM 1.2 mL中加目的基因的质粒和包装质粒摩尔比为1 ∶1，psPAS2 ∶Pmd2.G ∶shRNA plasmid为2(10 μg) ∶1(5 μg) ∶2(10 μg)制备质粒混合液，opti 1.2 mL中按1 ∶6 的比例加PEI 150 μL，静置20 min。将上述混合液加无抗培养基5 mL，6～8 h后换液，加培养基10 mL；于转染24、36、48及72 h各收1次病毒，0.45 μm滤头过滤；GC AGS细胞铺6孔板密度为60%～80%，设置非感染组和感染组，非感染组细胞加polybrene 2 μL、感染组细胞加病毒和polybrene 2 μL，24 h换液，细胞筛选、培养24 h，更换新鲜培养基，36 h加嘌呤霉素筛选；非感染组细胞全部被嘌呤霉素杀死则判断慢病毒稳转株构建成功。

1.2.5划痕实验 先用marker笔于6孔板背后做好标记，细胞按5×105个/孔接种使其均匀分布，5%CO2、37 ℃恒温恒湿培养24 h，待细胞长满后用10 μL枪头垂直于直尺，于6孔板孔内划2条垂直相交划痕；磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗细胞3次，去除悬浮细胞，加入含有1%血清培养基；置于5%CO2、37 ℃恒温恒湿培养箱培养，分别于0、24及36 h采用倒置显微镜观察、拍照。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 生物信息学分析

课题组前期通过TCGA数据库进行生物信息学分析发现ACTN4在GC中高表达，ACTN4高表达与肿瘤的淋巴结转移和分期相关；同时Kaplan-Meier Plotter数据库分析显示ACTN4增高提示患者预后不良(P<0.05)，综合分析提示在GC中肿瘤细胞的淋巴结转移及肿瘤分期与ACTN4表达相关，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

2.2 ACTN4 mRNA和蛋白的表达

结果显示，AGS细胞系中ACTN4 mRNA的表达量明显高于GES-1细胞系，差异有高度统计学意义(P<0.001)；与GES-1细胞系相比，AGS细胞系中ACTN4蛋白表达量上调，差异有统计学意义(P<0.05)；qRT-PCR检测结果表明，20例GC组织中ACTN4 mRNA表达量较癌旁组织高表达，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

2.3 敲低ACTN4后对AGS细胞迁移的影响

运用shRNA慢病毒干扰技术构建AGS细胞系ACTN4基因低表达细胞模型，Western blot检测ACTN4蛋白表达，结果显示sh-KD1组和sh-KD2组AGS细胞ACTN4蛋白表达水平分别低于sh-NC组(P<0.05)；划痕实验表明sh-KD1组和sh-KD2组AGS细胞24、36 h细胞划痕愈合率均分别较sh-NC组降低(P<0.05或P<0.01)。

3 讨论

ACTN4基因定位于染色体19q13.2，在肿瘤的转移中扮演着重要的角色[16]，课题组前期通过对公共数据库的分析结果显示，ACTN4基因在GC中高表达。数据库分析结果显示ACTN4基因高表达与肿瘤组织的淋巴结转移呈正相关，显示其与GC细胞的转移等密切相关，生物信息学分析结果与已报道文献大致相符[16]。此外，通过对TCGA数据库进行进一步生物信息学分析显示ACTN4在肿瘤组织中的高表达与分期呈正相关，但是不同分期之间差异无统计学意义(P>0.05)；在生存预后分析中，结果显示ACTN4高表达与预后呈负相关，表明ACTN4高表达可能提示患者预后不良。

注：A为TCGA数据库中ACTN4在GC组织和正常组织中的表达，B为Kaplan-Meier Plotter数据库分析中ACTN4基因与GC患者生存预后的关系，C、D为TCGA数据库分析ACTN4表达与GC分期和淋巴结转移的关系；与正常组织或Normal组比较，(1)P<0.001，(2)P<0.05。图1 ACTN4生物信息学分析Fig.1 Bioinformatics analysis of ACTN4

注：A、B分别为GC组织和GC细胞系中ACTN4 mRNA水平定量结果，C和D分别GC细胞系中ACTN4蛋白表达和定量结果；(1)与癌旁组织比较，P<0.05；与GES-1细胞比较，(2)P<0.001，(3)P<0.05。图2 GC细胞系、GC组织及癌旁组织中ACTN4 mRNA和蛋白的表达Fig.2 Expression of ACTN4 mRNA and protein in gastric cancer cell lines and tissues

注：A、B分别为ACTN4蛋白表达和定量结果，C、D分别为细胞划痕愈合面积和划痕愈合率结果；与同时点sh-NC组比较，(1)P<0.01，(2)P<0.05。图3 敲低ACTN4后对AGS细胞迁移的影响Fig.3 Effect of ACTN4 knockdown in migration of AGS cells

通过qRT-PCR对肿瘤GC细胞系和GC组织ACTN4 mRNA和蛋白表达情况进行检测，结果佐证ACTN4在GC中表达失调，与生物信息学分析结果相契合。ACTN4基因的表达失调往往预示着一些肿瘤侵袭转移的发生和病情的恶化，有研究显示ACTN4参与肿瘤细胞上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)过程，进一步显示其与肿瘤侵袭迁移的关系[14,17-20]。肿瘤细胞EMT过程能够促进细胞的侵袭、迁移行为，而肿瘤细胞侵袭和迁移往往提示患者病情较重、预后较差。EMT是指细胞由上皮细胞向间质细胞过渡的一个生物学行为和状态，主要表现为细胞形态由上皮样多边形向间质细胞样长梭形过渡，细胞间粘附连接破坏，上皮标志物E钙黏蛋白表达下调，间质细胞标志物N钙黏蛋白、波形蛋白及相关转录因子锌指E-box结合同源框1、Snail等表达上调，且EMT主要报道由Wnt/β-catenin等信号通路参与调节，进而促进细胞变形运动[10,21-25]。因此肿瘤细胞EMT被认为是肿瘤重要的生物学行为，是癌细胞转移的前置状态。本研究体外敲低ACTN4基因构建了AGS细胞系ACTN4敲低模型，并采用划痕实验对该模型迁移能力进行检测，结果显示敲低ACTN4后AGS细胞迁移能力减弱(P<0.05)。虽然研究中未检测EMT相关指标的表达变化，但是在敲低ACTN4后细胞迁移能力减弱，变形运动能力减低则有力佐证了ACTN4促进GCAGS细胞的转移。

结合生物信息学大数据预测结果分析表明，ACTN4在GC细胞系AGS中高表达，ACTN4高表达能够促进AGS细胞系的迁移，与GC患者的生存预后呈负相关关系。本研究主要优势在于通过生物信息学分析预测，并结合组织和细胞模型验证以及构建慢病毒稳转细胞系对GC中ACTN4基因的功能进行探索，但也存在一些不足，如未深入探索ACTN4的功能机制。