解毒通络方通过TGF-β1/Smad和ROCK通路对大鼠心肌纤维化的改善作用

2021-07-30郭家娟

吉林大学学报（医学版） 2021年4期

张丹,惠菊,郭家娟

（1.长春中医药大学附属医院心病中心，吉林长春130021；2.吉林省长春市中心医院心内一科，吉林长春130051）

心肌纤维化是心血管疾病发展到一定阶段的病理性改变，相当于中医学“心衰”范畴，发生于各类心系疾病的终末阶段。传统医学［1］认为：心肌纤维化病位在脉络，由于情志因素导致气失疏泄、气机郁滞，引起气滞血瘀，络脉瘀滞，同时气郁化火，火瘀成毒，瘀毒日久则阻滞脉络，损络伤营，导致心营受损，进而引发心肌纤维化和心肌重构，瘀毒及火毒贯穿于整个心肌纤维化进程，“毒伤血络”为心肌纤维化发生的基本病机。解毒通络方针对病因，从中医整体观念出发，以夏枯草、牛膝和茺蔚子组方，从行气、活血、散火和解毒入手，终致络脉通畅、气血调和，使毒邪有出路。研究［2-3］表明：解毒通络方可改善心衰患者胸闷、气短和乏力等症状，降低血压，并可降低自发性高血压大鼠血清Ⅰ型胶原含量，逆转心肌重构和心室肥厚，但其机制尚不清楚。心肌纤维化初始病因多种多样，其发生发展机制也十分复杂，涉及多种调控因子和信号通路［4］。血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）是研究最多的致心肌肥大和纤维化因子，转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是其最重要的下游因子，循环和局部AngⅡ浓度的升高均可刺激心肌成纤维细胞合成和分泌TGF-β1，后者通过Smad和Rho相关蛋白激酶（Rho-associated protein kinase，ROCK）途径加速心肌纤维化进程［5-6］。本研究通过盐酸异丙肾上腺素皮下注射法复制大鼠心肌纤维化模型，探讨解毒通络方基于TGF-β1/Smad和ROCK通路抑制大鼠心肌纤维化进程的机制，为其治疗心肌纤维化提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要试剂SPF成年Wistar雄性大鼠30只，体质量180～200 g，购自辽宁长生生物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK（辽）2015-0001，饲养于吉林大学医学实验动物中心。盐酸异丙肾上腺素（美国Sigma-Aldrich公司），卡托普利片（北京京丰制药集团有限公司），羟脯氨酸测定试剂盒（南京建成生物工程研究所），大鼠AngⅡ酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（武汉艾美捷科技有限公司），RNApure试剂盒、Reverse Transcriptase Kit（M-MLV）第一链反转录试剂盒、实时荧光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）试剂盒、RIPA裂解液、ECL显色试剂盒和Bradford蛋白定量试剂盒（北京庄萌生物技术有限公司），抗大鼠TGF-β1、LIM激酶（LIM kinase，LIMK）、Smad2/3、磷酸化Smad2/3（phosphorylated Smad2/3，p-Smad2/3）、ROCK、β-actin及HRP标记抗小鼠和家兔IgG（武汉爱博泰克生物科技有限公司）。夏枯草、牛膝和茺蔚子颗粒均购自四川新绿色四川新绿色科技发展有限公司，按质量比3∶2∶1混匀组成解毒通络方，颗粒质量标准符合《中华人民共和国药典》规定，使用前以一定体积80℃水溶解，冷却至室温备用。

1.2 实验动物分组和给药大鼠经适应性饲养1周后，随机分为正常对照组、模型组、卡托普利组、低剂量解毒通络方组和高剂量解毒通络方组，每组6只。除正常对照组外，其余各组大鼠均按5 mg·kg－1体质量单次皮下注射盐酸异丙肾上腺素复制大鼠心肌纤维化模型［4］，正常对照组大鼠注射等体积生理盐水。于造模第2天起，卡托普利组大鼠灌胃给予卡托普利片悬液0.005 g·kg－1·d－1，低和高剂量解毒通络方组大鼠分别灌胃给予解毒通络方冲剂悬液1和5 g·kg－1·d－1，正常对照组和模型组大鼠每日灌胃给予等体积蒸馏水，连续28 d。

1.3 HE染色和Masson三色染色观察大鼠心肌组织病理形态表现并计算胶原纤维面积百分率实验结束后取各组大鼠心肌组织用4%甲醛溶液固定，经常规石蜡包埋后制备5μm石蜡切片，分别行HE染色和Masson三色染色，用Image J软件（1.51t，美国国立卫生研究院）分析并计算各组大鼠心肌组织胶原纤维面积百分率。

1.4 大鼠心肌组织中羟脯氨酸和AngⅡ水平检测采用碱水解法检测大鼠心肌组织中羟脯氨酸水平。精确称取大鼠心肌组织50 mg，加水解液1 mL，经沸水浴20 min并冷却至室温后，按试剂盒说明书操作，经调节pH值、活性炭吸附、显色等步骤后于550 nm处测定各管吸光度（A）值，计算大鼠心肌组织中羟脯氨酸水平。羟脯氨酸水平（mg·g－1）=［（测定A值－空白A值）/（样本A值－空白A值）］×10。

精确称取大鼠心肌组织100 mg于1 mL 0.01 mol∙L－1PBS缓冲液中匀浆，取50μL按ELISA试剂盒说明书进行AngⅡ水平检测。每样本设双复孔，用酶标仪在450 nm波长处检测A值，根据标准曲线计算各组大鼠心肌组织中AngⅡ水平（mg·g－1）。

1.5 免疫组织化学法检测大鼠心肌组织中TGF-β1和LIMK蛋白表达水平大鼠心室组织经10%甲醛固定、石蜡包埋后制备5μm切片。切片经脱蜡至水、抗原修复及封闭处理后，分别滴加抗大鼠TGF-β1和LIMK抗体（均按1∶200稀释）4°C过夜。次日，充分洗片后滴加HRP-标记二抗，室温孵育20 min，洗片后DAB显色，采用苏木素复染细胞核，显微镜下观观察并拍照，采用ImageJ-Pro Plus 5.1图像分析软件分析阳性信号A值，以A值代表目的蛋白表达水平。

1.6 RT-qPCR法检测大鼠心肌组织中Smad2、Smad3和ROCK mRNA表达水平按照RNApure试剂盒说明书提取大鼠心肌组织总RNA，以随机引物进行逆转录反应合成cDNA，进行RT-qPCR。PCR所用引物由上海生工合成，引物序列见表1。以GAPDH为内参照，采用2－ΔΔCt法［7］计算大鼠心肌组织中Smad2、Smad3和ROCK mRNA相对表达水平。

表1 PCR引物序列T ab.1Primer sequences of PCR

1.7 Western blotting法检测大鼠心肌组织中p-Smad2/3和ROCK蛋白表达水平实验大鼠于末次给药2 h后处死，取100 mg心肌组织经RIPA裂解液处理，收集上清，采用Bradford法进行蛋白定量，采用Western blotting法检测各组大鼠心肌组织中Smad2/3、p-Smad2/3和ROCK蛋白表达水平。50μg（20μL）总蛋白经SDS-PAGE电泳分离、转膜和杂交等步骤，经ECL法显色后用上海天能Tanon 4200全自动化学发光成像分析系统成像，检测各阳性条带A值，目的蛋白表达水平=目的蛋白条带A值/GAPDH蛋白条带A值，以p-Smad2/3与Smad2/3蛋白表达水平比值代表p-Smad2/3蛋白表达水平。

1.8 统计学分析采用SPSS 26.0统计软件进行统计学分析。大鼠心肌组织中胶原纤维面积百分率，羟脯氨酸和AngⅡ水平，心肌组织中Smad2、Smad3和ROCK mRNA表达水平及p-Smad2/3和ROCK蛋白表达水平，均符合正态分布，以±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析（One-way AVOVA），组间样本均数两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心肌组织病理形态表现和胶原纤维面积百分率HE染色和Masson三色染色结果见图1。注射异丙肾上腺素28 d后，模型组大鼠心肌组织中可见境界清楚、大小不一心肌坏死灶，表现为心肌细胞溶解和断裂，坏死区内由大量胶原成分填充，呈典型纤维化改变；坏死灶主要分布在乳头肌及内层心肌，而中、外层心肌病灶少见。与模型组比较，卡托普利组和不同剂量解毒通络方组大鼠心肌组织上述病变均有不同程度减轻。Masson三色染色图像分析结果显示：模型组大鼠心肌组织胶原纤维面积几乎超过正常对照组的5倍（34.51%±6.18%vs6.38%±3.15%），差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，卡托普利组、低剂量解毒通络方组和高剂量解毒通络方组大鼠心肌组织中胶原纤维面积百分率（24.74%±5.38%、26.41%±5.97%和15.03%±4.40%）明显降低（P＜0.05），且高剂量解毒通络方组大鼠心肌组织胶原纤维面积百分率明显低于低剂量解毒通络方组和卡托普利组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 各组大鼠心肌组织中羟脯氨酸和AngⅡ水平与正常对照组比较，模型组大鼠心肌组织中羟脯氨酸和AngⅡ水平明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，卡托普利组和不同剂量解毒通络方组大鼠心肌组织中羟脯氨酸和AngⅡ水平明显降低（P＜0.05），且高剂量解毒通络方组大鼠心肌组织中羟脯氨酸水平明显低于低剂量解毒通络方组（P＜0.05）；与卡托普利组比较，低和高剂量解毒通络方组大鼠心肌组织中羟脯氨酸和AngⅡ水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.3 各组大鼠心肌组织中TGF-β1和LIMK蛋白表达水平正常对照组大鼠心肌组织中TGF-β1和LIMK呈低表达或不表达；注射异丙肾上腺素28 d后，模型组和各药物组大鼠心肌组织中TGF-β1和LIMK表达均明显增加。与正常对照组比较，模型组和各药物组大鼠心肌组织中TGF-β1和LIMK蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，卡托普利组和不同剂量解毒通络方组大鼠心肌组织中TGF-β1和LIMK蛋白表达水平均明显降低（P＜0.05）；与卡托普利组比较，低和高剂量解毒通络方组大鼠心肌组织中TGF-β1和LIMK蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。各组大鼠心肌组织TGF-β1和LIMK免疫组织化学染色结果见图2。

2.4 各组大鼠心肌组织中Smad2、Smad3和ROCK m RNA表达水平与正常对照组比较，模型组和各药物组大鼠心肌组织中Smad2、Smad3和ROCK mRNA表达水平均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，卡托普利组和不同剂量解毒通络方组大鼠心肌组织中Smad2、Smad3和ROCK mRNA表达水平均明显降低（P＜0.05）；与低剂量解毒通络方组比较，高剂量解毒通络方组大鼠心肌组织中Smad3 mRNA表达水平明显降低（P＜0.05），Smad2和ROCK mRNA表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

图1 各组大鼠心肌组织HE染色(A-E)和Masson三色染色(F-J)结果(×200)Fig.1Results of HE staining(A-E)and Masson tri-chrome staining(F-J)of myocardium tissue of rats in various groups(×200)

表2 各组大鼠心肌组织中羟脯氨酸和AngⅡ水平Tab.2Levels of hydroxyproline and AngⅡin myocardium tissue of rats in various groups [n=6，±s，w B/（mg·g－1）］

*P＜0.05 vs normal control group；△P＜0.05 vs model group；#P＜0.05 vs low dose of Jiedu Tongluo Decoction group.

Group Normal control Model Captopril Jiedu Tongluo Decoction Low dose High dose Hydroxyproline 0.16±0.03 0.42±0.04*0.30±0.04△0.34±0.03△0.28±0.02△#AngⅡ263.9±45.9 638.2±99.7*389.9±64.2△366.6±99.8△332.8±77.8△

表3 各组大鼠心肌组织中TGF-β1和LIMK蛋白表达水平Tab.3Expression levels of TGF-β1 and LIMK proteins in myocardium tissue of rats in various groupsn=6，±s）

*P＜0.05 vs normal control group；△P＜0.05 vs model group.

Group Normal control Model Captopril Jiedu Tongluo Decoction Low dose High dose TGF-β1 0.65±0.21 11.10±1.41*5.00±2.83*Δ 3.90±1.49*△1.40±1.51*△LIMK 0.35±0.11 12.84±1.29*8.22±1.92*Δ 6.41±1.51*△8.59±1.99*△

2.5 各组大鼠心肌组织中p-Smad2/3和ROCK蛋白表达水平与正常对照组比较，模型组大鼠心肌组织中pSmad2/3和ROCK蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，卡托普利组和不同剂量解毒通络方组大鼠心肌组织中p Smad2/3蛋白表达水平明显降低（P＜0.05），卡托普利组和高剂量解毒通络组大鼠心肌组织中ROCK蛋白水平明显降低（P＜0.05）；与卡托普利组比较，不同剂量解毒通络组大鼠心肌组织中pSmad2/3和ROCK蛋白表达水平差异均无统计学意义（P＞0.05）。见图3和表5。

3 讨论

中医理论［2，8］认为：阴阳失衡，脏腑功能失调，气血运行失畅，浊毒内生，败坏血络，如此循环往复，终致心体受损，心气虚衰而竭，刺激某些细胞合成和分泌大量细胞因子和趋化因子，并刺激某些特殊基因的异常表达，进而引起心肌成纤维细胞异常增殖，细胞外间质蛋白沉积增多，产生心肌纤维化。中医药在心肌纤维化治疗中有其独特优势，日益引起学者的重视［9-10］。本着治病求其本的原则，国医大师黄永生教授认为心肌纤维化的治疗应“针对病因，解毒通络”，并以夏枯草、牛膝、茺蔚子组成解毒通络方。方中夏枯草味苦辛、性寒，有疏通气血之功，其通络散结之能恰以调畅营气以散毒，为该方之君药；牛膝味甘酸，性平，具有补益肝肾，滋阴潜阳之功，为该方之臣药；茺蔚子味辛甘、微苦、微寒，性凉，具有顺气活血化瘀之能，祛瘀而通，上行而下达为佐使药；三药组合使阴阳平衡，气血畅通，营行毒除而通络。临床和

动物实验研究［2-3，11］显示：解毒通络方可明显改善患者胸闷、气短和乏力等症状，并可降低高血压大鼠心肌组织中Ⅰ型和Ⅲ型胶原水平，抑制或延缓AngⅡ诱导的自发性心肌纤维化进程。本研究结果显示：解毒通络方治疗28 d后，异丙肾上腺素致大鼠心肌纤维化程度明显减轻，心肌组织中羟脯氨酸和AngⅡ水平明显降低，与血管紧张素抑制剂（angiotensin converting enzyme inhibitor， ACEI）卡托普利治疗效果相近，表明解毒通络方可明显抑制心肌纤维化程度，延缓其进程。

图2 各组大鼠心肌组织TGF-β1(A-E)和LIMK(F-J)免疫组织化学染色结果（DAB，×200）Fig.2Results of immunohistochemical staining of TGF-β1(A-E)and LIMK(F-J)in myocardium tissue of rats in various groups(DAB,×200)

表4 各组大鼠心肌组织中Smad2、Smad3和ROCK mRNA表达水平Tab.4Expression levels of Smad2,Smad3,and ROCK mRNA in myocardium tissue of rats in various groups（n=6，-±s）

*P＜0.05 vs normal control group；△P＜0.05 vs model group；#P＜0.05 vs low dose of Jiedu Tongluo group.

Group Normal control Model Captopril Jiedu Tongluo Decoction Low dose High dose Smad2 mRNA 1.02±0.12 1.98±0.21*1.32±0.23*△1.56±0.29*△1.22±0.14*△Smad3 mRNA 1.00±0.15 2.08±0.28*1.43±0.26*△1.75±0.22*△1.24±0.24*△#ROCK mRNA 0.99±0.11 2.84±0.33*1.28±0.23*△1.45±0.24*△1.67±0.26*△

图3 各组大鼠心肌组织中Smad2/3、p-Smad2/3和ROCK蛋白表达电泳图Fig.3Expressionlevels of Smad2/3，p-Smad2/3,and ROCKproteins in myocardium tissue of rats in various groups

表5 各组大鼠心肌组织中p-Smad2/3和ROCK蛋白表达水平Tab.5Expression levels of p-Smad2/3 and ROCK proteins in myocardium tissue of rats in various groupsn=6，-±s）

*P＜0.05 vs normal control group；△P＜0.05 vs model group.

Group Normal control Model Captopril Jiedu Tongluo Low dose High dose p-Smad2/3 0.51±0.14 1.13±0.12*0.88±0.13*△0.85±0.16*△0.74±0.11*△ROCK 0.86±0.18 1.26±0.20*0.85±0.15△1.01±0.18 0.95±0.20△

由于心肌纤维化涉及各式各样的原始病因，不同病因所致胶原蓄积和心肌重构的具体机制也不尽相同。从总体上讲，心肌纤维化的发生发展涉及多种调控因子和信号通路，而且这些因子或通路之间还存在着错综复杂的相互依存与相互制约的关系。多种信号通路，如全身或局部肾素血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）、TGF-β1/Smad信号通路、ROCK信号通路、Wnt通路、整合素（Integrin）通路、丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）和Hippo信号通路等均被证实在心肌纤维化进程中起重要作用［12-14］。

AngⅡ作为强大的致心肌肥大和纤维化因子，可通过多种机制与上述信号途径相互作用，加速心肌纤维化进程。研究［15-17］证实：TGF-β1是AngⅡ最重要的下游信号因子，血液循环和局部AngⅡ浓度的增加均可刺激心肌成纤维细胞合成和分泌TGF-β1，后者通过Smad家族依赖和非依赖途径加速心肌纤维化进程。Smad依赖途径是TGF-β1的典型途径。经典TGF-β1/Smad途径信号系统由TGF-β超家族、TGF-β受体和Smads蛋白家族组成。细胞外TGF-β1与细胞膜TGF-β1受体Ⅱ结合并通过磷酸化作用募集细胞膜上的TGF-β1受体Ⅰ形成异二聚体，该异二聚体可磷酸化Smad2/3，继而与Smad4形成复合物并转移至细胞核调控Smad依赖性基因转录，使细胞外基质蛋白沉积增加，导致纤维化的形成［18］。

近年来研究［19］显示：ROCK途径也是促进心肌纤维化进展的重要途径，其激活并不依赖于Smad家族的磷酸化。ROCK是最早被发现的小G蛋白RhoA的下游效应因子，又称Rho激酶/Rho相关激酶，相对分子质量约为16 000，属于丝/苏氨酸激酶家族。研究［20-21］表明：ROCK可通过调节血清应答因子活性，上调TGF-β1、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）等的表达，增加细胞外基质（extracellular matrix，ECM）在心肌组织中的积聚；在ROCKl基因敲除大鼠心肌组织中成纤维细胞和肌成纤维细胞数量明显减少，ECM生成及心肌纤维化程度明显减轻，表明ROCK主要是通过影响心脏成纤维细胞的分化和心肌细胞凋亡等来实现的。最近的研究［22］显示：ROCK通路的促心肌纤维化作用可能与其激活LIM激酶1（LIM kinase 1，LIMK 1）有关，后者是一种调节成纤维细胞微管稳定性和肌动蛋白聚合的丝氨酸/苏氨酸激酶。有研究［23-24］显示：TGF-β1可诱导心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，并上调LIMK1的表达，而siRNA对LIMK1的下调可抑制TGF-β诱导的成纤维细胞-肌成纤维细胞的转化，提示TGF-β1相关的心肌纤维化可能与ROCK/LIMK1表达水平升高有关。

本研究结果显示：盐酸异丙肾上腺素注射后可使大鼠心肌组织出现典型心肌纤维化改变，同时心肌组织中AngⅡ水平明显增加，TGF-β1、Smad2/3、ROCK和LIMK蛋白表达水平明显升高，Smad2、Smad3和ROCKmRNA表达水平也明显升高；解毒通络方治疗后，大鼠心肌组织纤维化程度明显减轻，AngⅡ水平也明显降低，TGF-β1/Smad2/3通路和ROCK通路主要因子TGF-β1、Smad2、Smad3、ROCK及LIMK mRNA和蛋白表达水平均有所降低，提示解毒通络方治疗可通过下调TGF-β1/Smad2/3和ROCK通路相关因子的活性，进而抑制心肌组织中LIMK蛋白表达水平，从而延缓大鼠心肌纤维化进程。

ACEI是一类抑制血管紧张素转化酶活性的药物，通过抑制血管紧张素转化酶活性而减少AngⅡ生成量。研究［25］表明：除降压作用外，ACEI类药物还可通过多种机制抑制心肌组织胶原合成，并加速其降解，可预防或逆转自发性高血压大鼠及高血压患者的心肌纤维化。本研究以ACEI类药物卡托普利作为阳性对照药，结果显示：解毒通络方抑制心肌纤维化作用与常规剂量卡托普利作用相当，而解毒通络方具有以微观病理改变为要素的局部干预作用和宏观辨证为依据的整体调节作用相结合的独特优势，体现了中医学“病证结合”的治疗理念，因此采用解毒通络方治疗多种原因引起的心肌纤维化，在防治心肌纤维化中有广阔的发展前景。