雌二醇联合1，25-二羟维生素D3对绝经后骨质疏松症大鼠的治疗作用

2021-07-30李希宁沈哲源豆晓杰闵继康

吉林大学学报（医学版） 2021年4期

李希宁,翁伟,沈哲源,豆晓杰,闵继康

（1.湖州师范学院医学院病理学教研室，浙江湖州313000；2.湖州师范学院附属第一医院骨科，浙江湖州313000）

绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是一种常见的代谢性骨疾病，是绝经后女性卵巢功能减退及雌激素水平下降导致，雌激素通过影响骨细胞的活性进而导致骨密度降低［1］。在绝经后女性中，雌激素水平降低可促进破骨细胞分化，诱导骨细胞凋亡，并抑制成骨细胞分化功能［2-3］。临床常用激素替代疗法来治疗PMOP，但单纯口服雌二醇效果有限，用量过大容易产生如肿瘤、肥胖和消化系统症状等不良反应［4］。维生素D是一种微量营养素，可代谢为多功能类固醇激素，在体内具有广泛的生物学功能［5］。活性维生素D3在体内转化为1，25-二羟基维生素D3［1，25-dihydroxyvitamin D3，1，25（OH）2D3］，1，25（OH）2D3可诱导钙蛋白合成，促进小肠对钙离子的吸收，促进钙盐的更新及新骨生成，也可促进磷吸收及肾小管细胞对钙和磷的重吸收，进而提高血钙和血磷水平，有利于新骨生成和钙化［6-7］。临床上骨质疏松症治疗的目的是改善骨的负性重塑平衡，因此使骨代谢平衡变为正性至关重要［8］，建议患者在服用治疗骨质疏松的药物时补充活性维生素D3［9］，但其具体机制有待进一步研究。本研究通过复制大鼠PMOP模型，对比单纯应用雌二醇和雌二醇联合1，25（OH）2D3对大鼠血清生化指标和骨组织的影响，为临床预防和治疗PMOP提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器40只SD雌性大鼠购于上海杰思捷实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK（沪）2018-0004，饲养于浙江省湖州市食品药品检验研究院SPF级动物房。苯甲酸雌二醇注射液（广州白云山制药股份有限公司），1，25（OH）2D3（美国Sigma公司），碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨钙素（osteocalcin，OC）、骨保护素（osteoprotegerin，OPG）、Ⅰ型前胶原氨基端原肽（procollagen type i n-terminal propeptide，PINP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRACP）和核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）抗体（美国Abcam公司），逆转录（reverse transcription，RT）试剂盒（美国ThermoFisher公司），其他试剂均为国产分析纯。双能X射线骨密度仪（韩国Osteosys公司），三点力学生物仪（上海能共实业有限公司），倒置显微镜及照相系统（日本Olympus公司），PCR仪（美国ThermoFisher公司），凝胶电泳仪和成像系统（美国Bio-Rad公司）。

1.2 实验动物分组和模型建立40只雌性SD大鼠适应性喂养7 d后，随机分为对照组（10只）和手术组（30只）。手术组大鼠用10%水合氯醛0.3 mL·100 g－1腹腔注射麻醉，打开腹腔，摘除双侧卵巢，术后每只大鼠立即肌注青霉素50 000 U，每天肌注1次，持续3 d。术后喂养1周，将手术组大鼠随机分为模型组、雌二醇组和雌二醇联合1，25（OH）2D3组，每组10只。雌二醇组大鼠每周肌肉注射苯甲酸雌二醇0.05 mg·kg－13次；雌二醇联合1，25（OH）2D3组大鼠肌肉注射苯甲酸雌二醇的同时每天腹腔注射1，25（OH）2D31μg·kg－1。连续喂养24周，实验期间大鼠自由进食和进水。

1.3 大鼠血清学检测和骨组织形态表现观察实验结束后，乙醚麻醉大鼠，采血、分离血清，按照ELISA试剂盒说明书进行操作，全自动生化分析仪检测大鼠血清中ALP、OC、OPG、PINP、TRACP和RANKL水平。取大鼠左侧股骨用4%多聚甲醛溶液固定，EDTA脱钙液脱钙，以长针可刺入为准。流水过夜冲洗，定量浓度乙醇浸泡，石蜡包埋，切片，HE染色和TRACP染色，光镜下观察大鼠骨组织形态表现。

1.4 大鼠股骨骨密度（bone mineral density，BMD）检测和生物力学分析实验结束后取大鼠右侧股骨，采用双能X射线骨密度仪检测大鼠整只股骨BMD。BMD检测结束后，采用CTM 2050S万能拉力试验机，取大鼠右侧股骨全长，放入室温下的生理盐水当中浸泡3 h，取出恢复室温，两端用黏胶浇铸后放在间距为22 mm三点压缩实验台上，标本横截面短轴的方向与加速度方向一致，最大加载速度为2 mm·min－1，启动压力架开关，待股骨断裂后计算机得出各生物力学数据，包括骨组织弹性模量（elastic modulus）、刚度（stiffness）、最大应力（maximum stress）和最大承受力（maximum lord）。

1.5 采用RT-PCR法和Western blotting法检测大鼠骨组织中骨代谢指标m RNA和蛋白表达水平实验结束后取大鼠双侧胫骨，剥离肌肉和骨膜后快速置于液氮中冷冻60 min取出，置于研钵中磨碎。一侧胫骨加入TRIzol提取总RNA，并用Nano-Drop分光光度计测定RNA含量。按照High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit和Power SYBR®Green PCR Master Mix说明书合成cDNA并进行PCR扩增。采用StepOnePlus System software导出循环值（Ct），采用相对定量2－△△Ct法计算目的基因mRNA表达水平。引物序列见表1。

表1 ALP、OC、OPG和RANKL引物序列Tab.1Primer sequences of ALP,OC,OPG and RANKL

一侧胫骨磨碎后加入RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度，上样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），电泳后转到聚偏氟乙烯（PVDF）膜，5%脱脂奶粉封闭PVDF膜2 h后，加入一抗4℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗37℃孵育1 h，增强化学发光法（enhanced chamilium-inescence，ECL）显影，应用Gel Image System-1600凝胶成像系统采集图像并进行定量分析，计算目的蛋白表达水平，目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参条带灰度值。

1.6 统计学分析采用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析。各组大鼠血清中ALP、OC、OPG、PINP、TRACP和RANKL水平，各组大鼠股骨BMD、弹性模量、刚度、最大应力和最大承受力，各组大鼠骨组织中ALP、OC、OPG和RANKL mRNA及蛋白表达水平，均符合正态分布且方差齐，以±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清中成骨和破骨相关指标水平

与对照组比较，模型组大鼠血清中ALP、OC、OPG、PINP、TRACP和RANKL水平均明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，雌二醇组大鼠血清中ALP、OC、OPG、PINP、TRACP和RANKL水平明显降低（P＜0.01），雌二醇联合1，25（OH）2D3组大鼠血清中ALP、PINP、TRACP和RANKL水平明显降低（P＜0.01）且OPG/RANKL比值明显升高（P＜0.01）；与雌二醇组比较，雌二醇联合1，25（OH）2D3组大鼠血清中OC和OPG水平及OPG/RANKL比值明显升高（P＜0.01），TRACP和RANKL水平明显降低（P＜0.01）。见表2。

表2 各组大鼠血清中成骨和破骨相关指标水平Tab.2Levels of osteogenesis-and osteoclast-related indexes in serum of rats in various groups (n=6，±s）

*P＜0.01 vs control group；△P＜0.01 vs model group；＃P＜0.01 vs estradiol group.

Group Control Model Estradiol Estradiol combined with 1,25(OH)2D 3 ALP[λB/(U·L－1)]88.865±2.895 127.161±8.473*90.680±12.223△96.316±13.252△OC[ρB/(μg·L－1)]1.179±0.177 4.909±0.643*2.919±0.253△4.157±0.216＃OPG[ρB/(μg·L－1)]8.657±1.239 14.093±1.329*9.916±1.080△14.526±1.610＃PINP[ρB/(μg·L－1)]12.290±0.801 19.803±1.554*12.610±1.724△11.372±1.769△TRACP[λB/(U·L－1)]15.236±0.960 31.363±2.441*17.828±1.683△8.063±2.054△＃RANKL[ρB/(μg·L－1)]1.552±0.191 3.488±0.494*1.730±0.580△0.819±0.184△＃OPG/RANKL 5.663±1.273 4.133±0.899 6.005±2.044 18.226±3.414△＃

2.2 各组大鼠骨组织形态表现HE染色光镜下观察：对照组大鼠股骨骨外膜以纤维和成纤维细胞为主，骨膜厚度均匀；模型组大鼠骨膜厚度明显增加，破骨细胞数量增多且骨外膜下可见少许点状虫蚀状缺损，呈现典型骨质疏松症特点；雌二醇组大鼠骨膜厚度较模型组明显变薄，成骨与破骨细胞数量接近正常，骨组织形态特点接近正常骨组织；雌二醇联合1，25（OH）2D3组大鼠骨外膜填充着活跃的成骨细胞，其厚度明显增加，骨膜下无虫蚀状缺损，与对照组比较骨组织无明显变化（图1）。TRACP染色光镜下观察：对照组大鼠只有极少量功能活跃破骨细胞；模型组大鼠骨外膜下破骨细胞数量增多并且功能活跃；雌二醇组大鼠后骨外膜下破骨细胞数量较模型组减少，无虫蚀状缺损；雌二醇联合1，25（OH）2D3组大鼠骨外膜破骨细胞数量进一步减少，成骨细胞数量增多。见图2。

图1 HE染色观察各组大鼠骨组织形态表现（×200）Fig.1Morphology of bone tissue of rats in various groups observed by HE staining(×200)

图2 TRACP染色观察各组大鼠骨组织形态表现（×200）Fig.2Morphology of bone tissue of rats in various groups observed by TRACP staining(×200)

2.3 各组大鼠股骨BMD和生物力学指标与对照组比较，模型组大鼠股骨BMD、弹性模量、刚度、最大应力和最大承受力均明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，雌二醇组和雌二醇联合1，25（OH）2D3组大鼠大鼠股骨上述指标明显升高（P＜0.01）；与雌二醇组比较，雌二醇联合1，25（OH）2D3组大鼠股骨BMD、弹性模量和最大应力明显升高（P＜0.01）。见表3。

表3 各组大鼠股骨BMD和生物力学指标Tab.3Femoral BMD and biomechanical indexes of rats in various groups (n=5，±s）

*P＜0.01 vs control group；△P＜0.01 vs model group；＃P＜0.01 vs estradiol group.

Group Control Model Estradiol Estradiol combined with 1,25(OH)2D 3 BMD(mg·cm－2)123.645±10.167 67.092±5.110*97.870±5.557△132.234±11.911△＃Elastic modulus(P/Mpa)635.809±64.746 337.594±60.210*493.003±65.654△670.116±87.066△＃Stiffness(N·mm－1)872.072±38.823 612.921±106.258*813.682±22.937△856.421±42.933△Maximum stress(N·mm－2)21.131±1.535 9.138±1.723*15.624±3.054△20.524±1.707△＃Maximum lord(F/N)103.778±4.979 48.453±7.721*96.192±4.170△99.825±8.595△

2.4 各组大鼠骨组织中成骨和破骨相关指标mRNA和蛋白表达水平与对照组比较，模型组大鼠骨组织中ALP、OC、OPG及RANKL mRNA和蛋白表达水平均明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，雌二醇组大鼠骨组织中ALP、OC、OPG及RANKL mRNA和蛋白表达水平均明显降低（P＜0.01），雌二醇联合1，25（OH）2D3组大鼠骨组织中ALP、OC和RANKL mRNA和蛋白表达水平均明显降低（P＜0.01）；与雌二醇组比较，雌二醇联合1，25（OH）2D3组大鼠骨组织中ALP及OC mRNA和蛋白表达水平无明显变化（P＞0.05），OPG mRNA和蛋白表达水平明显升高（P＜0.01），RANKL mRNA和蛋白表达水平明显降低（P＜0.01）。见表4、图3和图4。

表4 各组大鼠骨组织中成骨和破骨相关指标mRNA表达水平T ab.4Expression levels of mRNA of osteogenesis-and osteoclast-related indexes in bone tissue of rats in various groups(n=3，±s）

*P＜0.01 vs control group；△P＜0.01 vs model group；＃P＜0.01 vs estradiol group.

Group Control Model Estradiol Estradiol combined with 1,25(OH)2D 3 ALP 1 1.551±0.173*1.041±0.102△1.060±0.279△OC 1 2.806±0.647*1.543±0.371△1.622±0.615△OPG 1 3.148±0.061*1.340±0.307△3.479±0.618＃RANKL 1 2.598±0.407*1.085±0.160△0.390±0.223△＃

图3 各组大鼠骨组织中成骨和破骨相关指标蛋白表达电泳图Fig.3Electrophoregram of expressions of osteogenesisand osteoclast-related index proteins in bone tissue of rats in various groups

3 讨论

骨组织在体内具有新陈代谢特点，表现为破骨细胞吸收旧骨、成骨细胞生成等量新骨取代以完成骨转换［10］。雌激素缺乏是引起PMOP的主要原因之一，雌激素能促进早期成骨细胞分化，刺激胶原蛋白并抑制破骨细胞活性［11］。绝经后女性雌激素严重不足，成骨细胞功能减弱而破骨细胞活性增加，BMD降低，增加骨转化率，影响钙盐沉积，使骨消融增加，大量骨质丢失，最终导致各类骨折的发生［12-13］。临床上常以激素替代（雌二醇）疗法治疗PMOP，但由于剂量依赖性常导致比较严重不良反应发生。因此，如何增强雌二醇调节PMOP中骨平衡功能，促进成骨细胞增殖和分化，并减少雌二醇用药剂量是亟需解决的问题。

维生素D是一种脂溶性维生素，也被看作是一种作用于钙、磷代谢的激素前体，通过体内转化转变成有活性的1，25（OH）2D3。在1，25（OH）2D3不足或缺乏的情况下，肠道钙吸收减少，导致血清钙细微减少，引起甲状旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）分泌增加［14］。持续升高的PTH不仅能增强维生素骨化三醇的活性，而且还能促进骨吸收［15］。因此，在1，25（OH）2D3不足或缺乏的情况下，骨重塑平衡变成负值［16］。研究［17］表明：1，25（OH）2D3可诱导破骨细胞形成，并发挥骨吸收活性，但1，25（OH）2D3对PMOP中成骨细胞的作用尚未见详细报道，尤其是其与雌激素的联合作用。本研究结果显示：与雌二醇组比较，雌二醇联合1，25（OH）2D3治疗后可明显促进大鼠骨组织中成骨细胞增殖，增加骨膜厚度，增强骨形成过程，同时抑制破骨细胞数量从而减弱绝经后骨质疏松中的骨转换加速。在骨转换过程中，骨代谢生化指标发挥重要调节作用［18］。临床专家共识中常用骨形成指标包括ALP、OC、PINP和OPG等，骨吸收指标包括TRACP、RANKL、Ⅰ型胶原C端肽（CTX）和I型胶原N端肽（NTX）等［19-20］。本研究结果显示：与雌二醇组比较，雌二醇联合1，25（OH）2D3组大鼠血清中代表骨形成的OC和OPG水平明显升高，代表骨吸收的TRACP和RANKL水平明显降低，说明1，25（OH）2D3能够明显增强大鼠体内成骨细胞功能，增强成骨活性，明显促进骨形成的同时明显抑制骨吸收。临床上将BMD低于绝经前女性绝对值2.5个或以上标准差作为骨质疏松症的诊断标准［21］。本研究通过进一步生物力学分析显示：雌二醇和1，25（OH）2D3联合用药比单纯雌二醇治疗能更好地增加PMOP大鼠的BMD，并增强骨组织承受能力，从而缓解骨质疏松进展。

图4 各组大鼠骨组织中成骨和破骨相关指标蛋白表达水平Fig.4Expression levelsof osteogenesis-and osteoclast-related index proteinsin bonetissueof ratsin variousgroups

综上所述，PMOP发生后补充雌二醇可以减弱PMOP中骨转换加速，在一定程度上增强骨形成并抑制骨吸收从而平衡骨代谢，而雌二醇联合1，25（OH）2D3治疗后能更加明显促进成骨细胞的增殖和成骨活性，从而延缓PMOP的发生。临床中可以以低剂量雌二醇联合1，25（OH）2D3治疗PMOP，降低过量激素替代导致的不良反应发生率。