α-酮戊二酸对L-羟脯氨酸产量的影响

蔡萌萌，刘子强，户红通，陈 宁，2，3，徐庆阳，2，3*

（1.天津科技大学 生物工程学院，天津 300457；2.代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室，天津 300457；3.天津市氨基酸高效绿色制造工程实验室，天津 300457）

L-羟脯氨酸是亚氨基酸L-脯氨酸羟基化后的产物[1]，其存在于明胶、胶原、细胞壁蛋白质中[2]，也存在于一些微生物的次级代谢产物中。L-羟脯氨酸作为一种稀有的亚氨基酸，在医药[3-5]、化工[6-8]、食品[9-10]和美容[11-13]等行业都具有广泛的应用。目前，生产L-羟脯氨酸的方法包括生物提取法、化学合成法和微生物发酵法，其中应用最广的生物提取法具有诸多弊端，正逐渐被市场淘汰[14]，而微生物发酵法正以其原料来源广泛、成本低、工艺环保等优势迅速发展起来。

采用微生物发酵法生产L-羟脯氨酸时，L-脯氨酸在羟化酶的催化作用下生成L-羟脯氨酸，此过程需要Fe2+作为催化辅因子，同时需要α-酮戊二酸和氧气的参与[15]，但是微生物细胞内合成的α-酮戊二酸含量有限，限制了L-羟脯氨酸的高效合成[16]。因此，本实验在L-羟脯氨酸发酵过程中外源添加α-酮戊二酸，通过改变α-酮戊二酸的添加量、添加时间和添加方式来探究α-酮戊二酸对L-羟脯氨酸发酵的影响，旨在提高L-羟脯氨酸产量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

大肠杆菌（Escherichia coli）4HYP：由天津科技大学代谢工程研究室提供。

1.1.2 培养基

种子培养基：葡萄糖30 g/L，酵母粉6 g/L，（NH4）2SO41 g/L，KH2PO42 g/L，柠檬酸0.5 g/L，维生素B1（vitamin B1，VB1）1 mg/L，维生素H（vitamin H，VH）0.3 mg/L。

发酵培养基：葡萄糖10 g/L，酵母粉3 g/L，（NH4）2SO41 g/L，KH2PO44 g/L，柠檬酸0.5 g/L，MnSO4·H2O 10 mg/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，FeSO4·7H2O 0.1 g/L，VB15 mg/L，VH 0.2 mg/L。

1.1.3 化学试剂

葡萄糖：西王药业有限公司邹平分公司；酵母粉：英国OXOID公司；（NH4）2SO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NaOH、FeSO4·7H2O：天津市光复科技发展有限公司；柠檬酸、MnSO4·H2O、H2O2：国药集团化学试剂有限公司；L-羟脯氨酸：北京索莱宝科技有限公司；对二甲氨基苯甲醛：上海三爱思试剂有限公司；硫酸：天津化学试剂二厂。实验所用化学试剂均为分析纯或生化试剂。

1.2 仪器与设备

LRH-250-A生化培养箱：广东省医疗器械厂；5L离位灭菌发酵罐、30 L在位灭菌发酵罐：上海保兴生物设备工程有限公司；KQ-C型全自控蒸汽发生器：上海奉贤协新机电厂；V-1200型可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；TG16-W微量台式高速离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培养方法

摇瓶培养方法：在无菌条件下，用接种环划取一环斜面菌种至含有30 mL种子培养基的500 mL圆底三角瓶中，200 r/min、37℃培养10 h，然后按发酵培养基体积10%的接种量将菌液接种至含有30 mL发酵培养基的500 mL挡板三角瓶中，pH 7.0～7.2、37℃、200 r/min培养，发酵过程中以苯酚红作指示剂，当发酵液红色褪去时，补加体积分数25%的氨水溶液至红色出现，当发酵液长时间不变色时，补加1 mL 60 g/L的葡萄糖溶液维持发酵进行。

发酵罐培养方法：在无菌条件下，将活化的斜面菌种（1个250 mL茄形瓶）接种于含3 L种子培养基的5 L发酵罐中进行种子培养，pH 7.0～7.2、温度37℃、溶氧25%～30%，当OD600nm值为15左右时，以10%的接种量将其接种到30 L发酵罐中进行发酵，接种后发酵液体积为14 L，通过发酵罐自动控制温度37℃、pH 7.0～7.2，通过调节转速和通风量控制溶氧水平在25%～30%，当溶氧快速上升时说明培养基中葡萄糖耗尽，此时调节补糖脉冲比，自动流加80 g/L的葡萄糖溶液，发酵过程中每隔2 h取样检测并记录数据。

1.3.2 测定方法

pH值：pH值采用发酵罐连接的pH电极和精密pH试纸（6.4～8.0）测定；溶氧：采用发酵罐连接的溶氧电极。

菌体OD600nm值：将待测发酵液进行适当倍数的稀释，分光光度计测定波长600 nm处的吸光度值，将得到的吸光度值与稀释倍数相乘即为菌体OD600nm值。

L-羟脯氨酸含量测定[17]：取适量L-羟脯氨酸发酵液13 000 r/min离心2 min去除菌体，得到上清液，取20 μL于1 mL 5%H2O2溶液中，加入2滴1%CuSO4溶液和1 mL 10%NaOH溶液，混合均匀后呈现淡黄色，室温反应10 min至颜色消失且无气泡产生，加入1mL1%对二甲氨基苯甲醛硫酸溶液，混匀后沸水浴5 min，颜色由粉红色变为暗红色，冷却后加入10mL蒸馏水，混合均匀，于波长560nm处测定吸光度值，以同样的方法测定20 g/L的L-羟脯氨酸标准溶液的吸光度值，通过计算得到L-羟脯氨酸含量，其计算公式如下：

代谢流平衡模型的建立方法参照参考文献[17]。

2 结果与分析

2.1 α-酮戊二酸添加量对L-羟脯氨酸发酵的影响

为了考察不同α-酮戊二酸添加量对L-羟脯氨酸发酵的影响，通过摇瓶实验，在发酵培养基中分别添加0、1 g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的α-酮戊二酸，每组设置3个平行，发酵24h后，菌体OD600nm值和L-羟脯氨酸产量情况如图1所示。

图1 不同α-酮戊二酸添加量对L-羟脯氨酸发酵的影响Fig.1 Effect of α-ketoglutarate addition on the fermentation of L-hydroxyproline

由图1可知，随着α-酮戊二酸添加量的增加，细菌的OD600nm值逐渐降低，当α-酮戊二酸添加量≤4 g/L时，菌体OD600nm值虽有减少，但减少的幅度并不显著，当添加量增加至5g/L时，菌体OD600nm值显著下降。当α-酮戊二酸添加量为0～4 g/L时，L-羟脯氨酸的产量随α-酮戊二酸的增加而逐步增加，且添加量在4g/L时，L-羟脯氨酸产量达到最大值12.75g/L，与未添加α-酮戊二酸的产量（7.03g/L）相比，提高了81.37%。这说明虽然α-酮戊二酸的添加会对菌体生长产生一定的抑制作用，但在一定范围内，外源添加α-酮戊二酸能有效缓解细胞内α-酮戊二酸含量不足的问题，使菌体高效合成L-羟脯氨酸。因此，α-酮戊二酸最适添加量为4 g/L。

2.2 α-酮戊二酸添加时间对L-羟脯氨酸发酵的影响

为了考察不同α-酮戊二酸添加时间对L-羟脯氨酸发酵的影响，分别在发酵0 h（培养基中）、6 h（发酵前期）、14 h（发酵中期）和22 h（发酵后期）加入4 g/Lα-酮戊二酸，同时以不添加α-酮戊二酸的发酵实验作为对照，发酵过程中菌体生长情况、L-羟脯氨酸产量及糖酸转化率如图2所示。

图2 不同α-酮戊二酸添加时间对菌体生长情况（A）、L-羟脯氨酸产量（B）及糖酸转化率（C）的影响Fig.2 Effects of different addition time of α-ketoglutarate on the cell growth(A),L-hydroxyproline yield(B)and glucose to acid conversion ratio(C)

由图2（A）可知，当0 h添加α-酮戊二酸时，菌体生长初期受到了严重的抑制作用，之后随着α-酮戊二酸的消耗，菌体生长速率基本恢复正常，但最终菌体OD600nm值只有98.5，与未添加α-酮戊二酸的菌体OD600nm值125.4相比，降低了27.31%；随着α-酮戊二酸添加时间的推移，菌体OD600nm值受到的影响逐渐减小，当22 h添加α-酮戊二酸时，菌体OD600nm值为117.7，与未添加α-酮戊二酸的OD600nm值相比，仅降低了6.79%。

由图2（B）可知，当外源添加α-酮戊二酸后，L-羟脯氨酸的产酸速率明显提高，随着α-酮戊二酸的消耗，产酸速率恢复常规水平，当发酵前期添加α-酮戊二酸时，虽然摇瓶实验中，L-羟脯氨酸的产量得到了明显提高，但在发酵罐中进行发酵时，L-羟脯氨酸的产量并未获得提升，这可能是由于前期菌体生长受到抑制，菌体总量较低导致的；当22 h添加α-酮戊二酸时，L-羟脯氨酸最终产量达47.21 g/L，与不添加α-酮戊二酸的产量42.03g/L相比，提高了12.32%。

由图2（C）可知，22h添加α-酮戊二酸时L-羟脯氨酸的糖酸转化率最高，达到20.77%，与不添加α-酮戊二酸的19.79%相比，提高了4.95%。

通过改变α-酮戊二酸的添加时间，L-羟脯氨酸的产量和糖酸转化率获得了一定程度的提高，但并没有达到理想水平，这可能是由于添加α-酮戊二酸时采用的是分批补料策略，即将其一次性加入发酵液中，导致了发酵液中α-酮戊二酸浓度瞬间升高，严重抑制了菌体生长，同时随着α-酮戊二酸的消耗，产酸速率未能一直维持较高水平，因此，接下来考虑采用连续补料策略进行L-羟脯氨酸的发酵。

2.3 α-酮戊二酸连续补料策略对L-羟脯氨酸发酵的影响

为了研究α-酮戊二酸连续补料策略对L-羟脯氨酸发酵的影响，分别添加3 g/L、4 g/L、5 g/L和6 g/L（初始发酵液）α-酮戊二酸溶液至糖溶液中，当发酵底糖耗尽时，使α-酮戊二酸随糖流加入发酵液，发酵过程中菌体生长情况、L-羟脯氨酸产量及糖酸转化率如图3所示。

图3 α-酮戊二酸连续补料策略对菌体生长情况（A）、L-羟脯氨酸产量（B）及糖酸转化率（C）的影响Fig.3 Effect of continuous feeding strategy of α-ketoglutarate on the cell growth(A),L-hydroxyproline yield(B)and glucose to acid conversion ratio(C)

由图3（A）可知，当随糖流加α-酮戊二酸的含量≤5 g/L时，对菌体生长没有太大影响，当随糖流加α-酮戊二酸含量增加至6 g/L时，菌体OD600nm显著下降。由图3（B）可知，菌体的产酸能力明显提高，且到发酵后期菌体依然保持较高活力，与分批补料策略相比，发酵时间延长了6 h，产量大大提高；在一定范围内，随着α-酮戊二酸流加浓度的增加，L-羟脯氨酸产量逐渐升高，当随糖流加α-酮戊二酸含量为5 g/L时，L-羟脯氨酸的产量最高，达62.14 g/L，与不添加α-酮戊二酸相比，提高了47.85%，与22 h时一次性加入α-酮戊二酸相比，提高了31.62%，但当随糖流加α-酮戊二酸含量＞5 g/L之后，因α-酮戊二酸对菌体生长的影响使得产量未能继续提升。由图3（C）可知，当随糖流加α-酮戊二酸含为5 g/L时，L-羟脯氨酸发酵糖酸转化率达到最大值22.37%，与不添加α-酮戊二酸和22 h一次性加入α-酮戊二酸相比，分别提高了13.04%和7.70%。

2.4 α-酮戊二酸连续补料对L-羟脯氨酸代谢流的影响

根据L-羟脯氨酸发酵过程中菌体生长情况，假设22～28 h期间细胞处于拟稳态，检测该阶段发酵液中L-羟脯氨酸、葡萄糖、丙酮酸、乳酸、乙酸及赖氨酸的浓度，计算其积累或消耗速率，利用MATLAB软件计算分析，得到L-羟脯氨酸生物合成途径的代谢流分布情况，结果如图4所示。

图4 L-羟脯氨酸合成代谢流分布Fig.4 Synthetic metabolic flux distribution of L-hydroxyproline

由图4可知，当发酵过程中不添加α-酮戊二酸时，进入糖酵解途径（glycolytic pathway，EMP）的代谢流为58.01，进入磷酸戊糖途径（pentose phosphate pathway，HMP）的代谢流为41.99，从异柠檬酸（isocitric acid，ICI）进入乙醛酸循环和三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA）的代谢流分别为3.69和147.43，主要副产物乙酸合成的代谢流为5.54，产物L-羟脯氨酸合成的代谢流为26.96，当随糖流加5 g/L α-酮戊二酸时，进入EMP途径的代谢流提高到53.60，进入HMP途径的代谢流下降为46.40，从ICI进入乙醛酸循环的代谢流为3.39，进入TCA循环的代谢流为145.26，同时，乙酸合成的代谢流（3.91）明显减少，L-羟脯氨酸合成的代谢流（30.19）显著增加，与不添加α-酮戊二酸的相比，L-羟脯氨酸合成的代谢流提高了11.98%，乙酸合成代谢流减少了29.42%。可见，α-酮戊二酸的加入可有效降低副产物乙酸的生成，使更多的代谢流流向L-羟脯氨酸的合成途径。

3 结论

菌体细胞内L-羟脯氨酸的合成需要α-酮戊二酸的参与，但往往细胞自身合成的α-酮戊二酸含量有限，不能满足需要，因此本研究通过在L-羟脯氨酸发酵过程中外源添加α-酮戊二酸来解决这一问题。实验结果表明，在L-羟脯氨酸发酵过程中，外源添加α-酮戊二酸能有效提高L-羟脯氨酸的产量和糖酸转化率，但α-酮戊二酸对菌体生长有一定的抑制作用，所以其添加浓度应该控制在一定范围内；当采用连续补料策略，使α-酮戊二酸随糖流加，质量浓度在5 g/L时，L-羟脯氨酸产量能够达到最大值62.14 g/L，糖酸转化率为22.37%，与不添加α-酮戊二酸相比，分别提高了47.85%、13.04%，同时，L-羟脯氨酸的合成代谢流提高了11.98%，副产物乙酸合成代谢流减少了29.42%。