微小RNA-744-5p靶向整合素连接激酶对膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响

张跃，孙彦申

膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤，具有较高的发病率和死亡率。膀胱癌的生物学特征较为复杂，具有多发灶、易复发和转移等特征。复发和转移是膀胱癌病人治疗失败和死亡的主要原因。目前，膀胱癌的发病机制尚不清楚，研究其发病机制并寻找新的有效治疗靶点十分有必要。miR-744-5p是微小RNA（miRNA）家族成员，参与多种疾病发展进程。刘红军等用miRNA 芯片检测姜黄素对膀胱癌细胞miRNA 表达图谱的影响时发现，姜黄素可上调膀胱癌细胞中miR-744-5p 表达。然而，miR-744-5p 对膀胱癌细胞恶性表型的影响还未知。生物信息学软件预测显示，miR-744-5p 可能靶向调控ILK 表达。整合素连接激酶（integrin-linked kinase，ILK）是哺乳动物细胞中的主要信号传导分子，参与调控肿瘤细胞恶性表型。研究显示，膀胱癌组织中ILK 表达升高，且ILK 高表达与膀胱癌病理分化程度密切相关，检测ILK 水平有助于膀胱癌的临床诊断与预后，沉默ILK 基因表达可阻碍膀胱癌细胞增殖、侵袭及上皮间质转化（EMT）。本研究主要探讨了miR-744-5p 对膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响以及其是否通过调控ILK表达发挥作用。

1 材料与方法

1.1 组织样本

选取2016 年2 月至2018 年11 月本院接收的56 例经病理切片确诊的膀胱癌病人的癌组织和对应的癌旁组织。其中男性31 例，女性25例，年龄36～71 岁，平均年龄（52.29±6.71）岁。所有病人均未接受任何治疗，如放疗、化疗等。病人或其近亲属知晓本研究，并签署知情同意书。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》的相关要求。

1.2 细胞和实验试剂

膀胱癌BIU-87、T739 细胞，中国科学院上海细胞库；胎牛血清（FBS），杭州四季青；RPMI 1640 培养基，美国 Hyclone 公司；Lipofectamine2000 试剂盒，美国 Invitrogen 公司；四氮唑蓝（MTT），美国 Sigma 公司；miR-744-5p mimcs、miR-NC、anti-miR-744-5p、anti-miR-NC、ILK 的小干扰RNA（si-ILK）及阴性对照si-NC、ILK 过表达载体（pcDNA3.1-ILK）及空载体pcDNA3.1，上海吉玛公司；Trizol 试剂、逆转录试剂盒和PCR 试剂盒，大连宝生物；鼠抗人细胞周期蛋白（Cyclin D1）、P21、ILK单克隆抗体，美国Santa Cruz 公司；鼠抗人基质金属蛋白酶（MMP-2）和钙黏附蛋白E（E-cadherin）单克隆抗体，福州迈新生物技术有限公司；双荧光素酶活性检测试剂盒，威格拉斯生物技术（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1

细胞培养及转染 复苏BIU-87、T739 细胞，均用含10%FBS 的RPMI1640 培养基培养。取对数期BIU-87、T739细胞，均接种于6孔板中（1.0×10个/孔），培养24 h 后，更换为不含血清的RPMI 1640 培养基。利用LiPofectamine2000 脂质体转染法，将miR-744-5p mimcs（miR-744-5p 组）、anti-miR-744-5p（anti-miR-744-5p 组）、si-ILK（si-ILK 组）、miR-NC（miR-NC 组）、anti-miR-NC（anti-miR-NC 组）、si-NC（si-NC 组）、miR-744-5p mimcs 与 pcDNA3.1-ILK（miR-744-5p+pcDNA-ILK 组）、miR-744-5p mimcs 与pcDNA3.1（miR-744-5p+pcDNA 组）分别转染至BIU-87、T739 细胞。转染12 h 后，更换新鲜培养基。再培养24 h 后，实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测细胞中miR-744-5p、蛋白质印迹法（Western Blotting）检测细胞中ILK 蛋白表达验证转染效果，并收集细胞用于后续实验。

1.3.2

qRT-PCR 检测 miR-744-5p 表达 用 Trizol试剂提取组织或细胞中总RNA，逆转录为cDNA 后，行PCR扩增。引物序列miR-744-5p正向5′-CTGTTGCCACTAACCTCAACCT-3′，反向 5′-TGCGGGGCTAGGGCTAACAGCA-3′；U6 正向 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向 5′-A ACGCTTCACGA ATTTGCGT-3′。用2法计算组织或细胞中miR-744-5p相对U6的表达量。

1.3.3

细胞增殖实验 将各组转染后的BIU-87、T739 细胞均接种于96 孔板中（1.0×10个/孔），培养24、48、72 h 后，加 20 μL MTT（5 g/L）。孵育 4 h 后，弃培养基，加150 μL 二甲基亚砜，混合均匀，酶标仪490 nm处测OD值。实验重复3次。

1.3.4

Transwell 实验 将各组转染后的BIU-87、T739细胞用不含不含FBS的RPMI 1640培养基调整密度为2.5×10个/mL。迁移实验：取100μL 细胞悬液加至 Transwell 上室，500μL 含 10 %FBS 的 RPMI 1640 培养基加至下室。培养24 h 后，弃培养基，取出小室，用甲醛固定、结晶紫染色后，用显微镜观察，计数。侵袭实验：预先在Transwell 上室铺Matrigel基质胶，自然晾干后，再加100μL细胞悬液，后续步骤同迁移实验。

1.3.5

Western Blotting 法检测蛋白表达 将各组转染后的 BIU-87 细胞均接种于 6 孔板中（1.0×10个/孔），培养48 h 后，用RIPA 试剂提取细胞中总蛋白，BCA 法测蛋白浓度。然后行12%SDS-PAGE 电泳、转膜及5%脱脂牛奶中封闭1 h 后，在4 ℃并箱中分别 用 Cyclin D1（1∶500）、P21（1∶500）、MMP-2（1∶1 000）、E-cadherin（1∶1 000）和 GAPDH 一抗孵育过夜。洗膜后，再于37 ℃摇床中用山羊抗兔二抗（1∶2 000）孵育2 h。加入显影液，避光显影后，凝胶成像系统曝光拍照，Image J 软件分析目的蛋白相对GAPDH的表达量。

1.3.6

双荧光素酶报告基因实验 根据miR-744-5p 与 ILK 的 3’UTR 序列的结合位点，合成 ILK 目的基因；同时将结合位点突变，合成ILK 突变基因。以pGL3 为载体，Xho I 和 Kpn I 为插入位点，获得 ILK基因野生型质粒WT-ILK 及突变型质粒MUT-ILK。取对数期 BIU-87、T739 细胞接种于24 孔板中（2.5×10个/孔），培养 24 h 后，弃培养基。利用 Lipofectamine2000 试 剂 盒 ，将 WT-ILK 与 miR-744-5p mimics 或 miR-NC、MUT-ILK 与 miR-744-5p mimics或miR-NC+ pGL3-MUT-ILK 分别共转染至BIU-87、T739 细胞。转染12 h 后，更换新鲜的培养基。再培养24 h后，裂解细胞，离心（3 500 r/min、5 min）后，取上清液，检测荧光素酶活性，结果以萤火虫与海肾的荧光强度比较表示。

2 结果

2.1 miR

-

744

-

5p 在癌旁组织和膀胱癌组织中的表达

癌旁组织、膀胱癌组织中miR-744-5p 的表达水平分别为（0.98±0.10）、（0.25±0.02），两者比较差异有统计学意义（

t

=21.475，

P

＜0.05）。

2.2 过表达miR

-

744

-

5p或抑制miR

-

744

-

5p表达对BIU

-

87、T739细胞增殖的影响

转染miR-NC、miR-744-5p mimics 的 BIU-87 细 胞中 miR-744-5p 表 达 水平分别为（1.09±0.11）、（3.11±0.31），T739 细胞中miR-744-5p 表达水平分别为（1.02±0.10）、（2.56±0.26），两者比较差异有统计学意义（

t

=18.423，

P

＜0.05；

t

=16.585，

P

＜0.05），表明 miR-744-5p mimics 转染成功，过表达 miR-744-5p 的 BIU-87、T739 细胞构建成功。miR-744-5p 组 BIU-87、T739 细胞 OD 值和Cyclin D1 蛋白表达低于miR-NC 组（

P

＜0.05），而P21蛋白表达高于 miR-NC 组（

P

＜0.05）。见图 1，表1，表2。

表1 过表达miR-744-5p对BIU-87细胞增殖的影响/

表2 过表达miR-744-5p对T739细胞增殖的影响/

图1 过表达miR-744-5p对BIU-87、T739细胞增殖蛋白表达的影响：A为过表达miR-744-5p对BIU-87细胞增殖蛋白表达的影响；B为过表达miR-744-5p对T739细胞增殖蛋白表达的影响

转 染 anti-miR-NC、anti-miR-744-5p mimics 的BIU-87 细胞中 miR-744-5p 表达水平分别为（1.03±0.10）、（0.35±0.03），T739 细胞中 miR-744-5p 表达水平分别为（1.01±0.11）、（0.31±0.04），两者比较差异有 统 计 学 意 义（

t

=19.540，

P

＜0.05；

t

=17.942，

P

＜0.05），表明 anti-miR-744-5p 转染成功，抑制 miR-744-5p 的 BIU-87、T739 细胞构建成功。anti-miR-744-5p 组 BIU-87、T739 细 胞 细 胞 OD 值 高 于 antimiR-NC组（

P

＜0.05）。见表3。

表3 抑制miR-744-5p对BIU-87、T739细胞增殖的影响/

2.3 过表达miR

-

744

-

5p或抑制miR

-

744

-

5p表达对BIU

-

87、T739 细胞迁移和侵袭的影响

miR-744-5p组 BIU-87、T739 细胞的迁移数、侵袭数和 MMP-2 蛋白表达低于miR-NC 组（

P

＜0.05），而E-cadherin 蛋白表达高于miR-NC组（

P

＜0.05）。见图2，表4，表5。

表4 过表达miR-744-5p对BIU-87细胞迁移和侵袭的影响/

表5 过表达miR-744-5p对T739细胞迁移和侵袭的影响/

图2 过表达miR-744-5p对BIU-87、T739细胞迁移、侵袭蛋白表达的影响：A为过表达miR-744-5p对BIU-87细胞迁移和侵袭蛋白表达的影响；B为过表达miR-744-5p对T739细胞迁移和侵袭蛋白表达的影响

anti-miR-744-5p 组 BIU-87、T739 细胞迁移数、侵袭数升高于anti-miR-NC组（

P

＜0.05）。见表6。

表6 抑制miR-744-5p对BIU-87、T739细胞迁移、侵袭的影响/

2.4 miR

-

744

-

5p 靶向调控ILK 的表达

生物信息学软件显示的 ILK 的 3’UTR 与 miR-744-5p 的互补序列见图3A。共转染miR-744-5p 与WT-ILK 的BIU-87、T739 细胞荧光素酶活性低于共转染miRNC 与 WT-ILK 的 BIU-87、T739 细胞（

P

＜0.05），而共转染 miR-744-5p 与 MUT-ILK 的 BIU-87、T739 细胞荧光素酶活性与共转染miR-NC 与MUT-ILK 的BIU-87、T739 细胞比较差异无统计学意义，说明miR-744-5p 在 BIU-87、T739 细胞中可与 ILK 的 3’UTR 靶向结合。与 miR-NC 组相比，miR-744-5p 组 BIU-87、T739 细胞 ILK 蛋白水平显著降低（

P

＜0.05）；antimiR-NC 组相比，anti-miR-744-5p 组 BIU-87、T739 细胞ILK 蛋白水平显著升高（

P

＜0.05），说明miR-744-5p靶向结合并负调控ILK。见图3，表7，表8。

表7 双荧光素酶报告实验/

表8 miR-744-5p调控BIU-87、T739细胞中ILK蛋白表达/

图3 miR-744-5p靶向调控ILK：A为ILK的3’UTR含有miR-744-5p的互补序列；B为miR-744-5p对BIU-87细胞ILK蛋白表达的影响；C为miR-744-5p对T739细胞ILK蛋白表达的影响

2.5 过表达ILK 逆转了miR

-

744

-

5p 对BIU

-

87、T739 细胞增殖、迁移和侵袭的影响

miR-744-5p+pcDNA3.1-ILK 组 BIU-87、T739 细胞 OD 值、迁移数、侵袭数及Cyclin D1 和MMP-2 蛋白表达高于miR-744-5p+pcDNA3.1 组（

P

＜0.05），但 P21 和 E-cadherin蛋白表达低于miR-744-5p+pcDNA3.1 组（

P

＜0.05）。见图4，表9～12。

图4 过表达ILK能逆转miR-744-5p对BIU-87、T739细胞增殖、迁移、侵袭蛋白表达的影响：A为过表达ILK逆转miR-744-5p对BIU-87细胞增殖、迁移和侵袭蛋白表达的影响；B为过表达ILK逆转miR-744-5p对T739细胞增殖、迁移和侵袭蛋白表达的影响

表9 过表达ILK逆转miR-744-5p对BIU-87细胞增殖的影响/

表10 过表达ILK逆转miR-744-5p对T739细胞增殖的影响/

表11 过表达ILK逆转miR-744-5p对BIU-87细胞迁移和侵袭的影响/

表12 过表达ILK逆转miR-744-5p对T739细胞迁移和侵袭的影响/

3 讨论

miRNA 是一类小分子单链非编码RNA，其可通过调控靶基因的表达影响细胞的生物学行为，参与肿瘤发生和发展。研究显示，miR-744-5p 在卵巢癌细胞系中表达降低，通过直接靶向HNRNPC 和NFIX 诱导卵巢癌细胞凋亡。miR-744-5p 参与调节乳腺浸润性微乳头状癌（IMPC）对紫杉醇的耐药性，可作为IMPC 的分子标志物。高表达miR-744-5p 可通过靶向抑制UBE2L3 的表达抑制前列腺癌细胞增殖，迁移，侵袭等恶性表型，其在前列腺癌中发挥抑癌基因作用。目前，miR-744-5p 对膀胱癌的影响还未知。本研究结果显示，膀胱癌组织中miR-744-5p 呈低表达，膀胱癌 BIU-87、T739 细胞转染miR-744-5p mimics 后，细胞的增殖、迁移和侵袭能力降低，而转染miR-744-5p 抑制剂后，细胞的增殖、迁移和侵袭能力提高，表明miR-744-5p 在膀胱癌组织中活性丧失，恢复癌细胞中miR-744-5p 表达可降低癌细胞的恶性生物学行为，提示miR-744-5p作为抑癌基因参与膀胱癌的发生和发展，其活性丧失可能是导致膀胱癌发生和发展的因素之一，有希望成为膀胱癌治疗的分子靶点。

为了进一步探究miR-744-5p 抑制膀胱癌细胞恶性表型的分子机制，本研究证实了miR-744-5p 可靶向结合并负调控ILK。ILK 是细胞内具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性的信号蛋白，参与调控肿瘤的发生和发展。研究显示，沉默ILK 表达可抑制胰腺癌、人舌癌等肿瘤细胞的增殖和侵袭能力，而过表达ILK 可促进胃癌、肺癌等肿瘤细胞的增殖和迁移。这说明ILK 可能在不同肿瘤中发挥的作用。膀胱癌组织中ILK 表达升高，联合检测ILK 与AKT、β-catenin 有助于判断膀胱癌的恶性程度。本研究结果显示，过表达ILK 可有效降低过表达miR-744-5p 对膀胱癌 BIU-87、T739 细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用，这进一步提示miR-744-5p 可能通过靶向抑制ILK 的表达来阻碍膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭。