磺胺嘧啶鱼肝油滴鼻剂微生物限度检查方法的建立

李敏，龚亚，曹健，邢茂

磺胺嘧啶鱼肝油滴鼻剂为陆军军医大学第二附属医院的自制制剂［中国人民解放军中央军委后勤部卫生局非标准制剂，批准文号：总制字（2018）F705015］，其主要成分为磺胺嘧啶、鱼肝油，用于治疗鼻黏膜糜烂性溃疡，鼻中隔手术后促进肉芽生长，加速伤口愈合，并有润滑鼻黏膜的作用。根据《中国药典》（2015 年版）规定，对含抑菌成分的制剂进行微生物限度检查时，应先消除供试品相应成分的抑菌活性，再依法进行检查，以保证方法的适用性。该制剂因含有磺胺类抑菌成分，无法通过简单一种方法进行试验，因此需要采用多种方法进行研究及比较，并选取最优且符合中国药典标准的方法进行其微生物限度检查。本研究拟通过采用平皿法、培养基稀释法和中和法，降低或消除其抑菌作用，建立磺胺类药物科学的微生物限度检查方法。也为其他有类似抑菌性的药品建立微生物限度方法学验证提供相应的借鉴。

1 仪器与试药

1.1 仪器

BP-Ⅱ型架盘天平（上海医用激光仪器厂）；LRH-70 型生化培养箱（上海一恒科技有限公司）；M0ST-T24-B 型台式灭菌器（山东新华有限公司）；CS101-2ABN 型电热鼓风干燥箱（重庆永生有限公司）；BSC-1000-Ⅱ-A2 型生物安全柜（苏州华宇有限公司）。

1.2 供试品

磺胺嘧啶鱼肝油滴鼻剂（批次190422，190730，191223），为陆军军医大学第二附属医院自制。

1.3 菌株

金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、铜绿假单胞菌［CMCC（B）10104］、枯草芽孢杆菌［CMCC（B）63501］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］由中国食品药品检定研究院菌种保藏中心提供，均为1代冷冻保存菌株；黑曲霉［CMCC（F）98003］由北京三药科技提供，为4代冷冻保存菌株。

1.4 培养基、试剂及稀释液

胰酪大豆胨琼脂培养基（批次180427）、胰酪大豆胨液体培养基（批次171218）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（批次170316）、沙氏葡萄糖液体培养基（批次161118）、麦康凯液体培养基（批次170313）、麦康凯琼脂培养基（批次171211）、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基（批次181227）、甘露醇氯化钠琼脂培养基（批次180326）均购自北京陆桥有限公司，经过适应性试验验证符合《中国药典》2015 年版四部规定；聚山梨酯-80（成都市科隆化学品有限公司，批次2017091901）、对氨基苯甲酸（上海化学试剂总厂，批次82-12-01）；稀释液为0.9 %氯化钠注射液（四川科伦药业股份有限公司，批次M18050704）。

2 方法与结果

2.1 供试液的制备

取磺胺嘧啶鱼肝油滴鼻剂10 mL，加入10 mL 聚山梨酯-80，用稀释液逐级稀释制成1∶10、1∶100供试液。

2.2 菌液的制备

按照《中国药典》2015 年版四部通则1105 和1106 中规定的菌液制备方法，制成适宜浓度的各菌悬液。

2.3 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法的适用性试验

取上述磺胺嘧啶鱼肝油滴鼻剂供试液9.9 mL 于灭菌试管中，加入金黄色葡萄球菌菌悬液0.1 mL，使供试液中含试验菌不大于100 cfu/mL，同法制备含铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉不大于100 cfu/mL 的供试液。平皿法：分别取各供试液1 mL，置无菌平皿中，每皿1 mL；培养基稀释法：分别取供试液1 mL，置2 个或5 个无菌平皿中，使每皿 0.5 mL 或 0.2 mL。注入 15～20 mL 温度不超过45 ℃熔化的琼脂培养基，混匀，凝固。胰酪大豆胨琼脂培养基于32.5 ℃培养2 d，作需氧菌计；沙氏葡萄糖琼脂培养基于22.5 ℃下培养3 d，作霉菌和酵母菌计，作为试验组。供试品对照组以稀释液代替菌液，菌液对照组以稀释液代替供试液，乳化剂对照组以聚山梨酯-80 代替供试品，其余均同试验组操作。每株试验菌平行制备两组。该操作在C级背景下的A级单向流空气区域内进行。

磺胺嘧啶鱼肝油滴鼻剂的三个不同批次进行试验，计算回收率：试验组的回收率=（试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数）/菌液对照组平均菌落数；乳化剂对照组的回收率=乳化剂对照组平均菌落数/菌液对照组平均菌落数。从表1 可以看出，平皿法（1 毫升/皿）适用于磺胺嘧啶鱼肝油滴鼻剂的霉菌和酵母菌计数检查，但无法消除其需氧菌计数检查中枯草芽孢杆菌的检查；培养基稀释法（0.2 毫升/皿）适用于磺胺嘧啶鱼肝油滴鼻剂的需氧菌计数检查。10%的聚山梨酯-80 不会干扰上述各菌株的生长。

表1 需氧菌、霉菌和酵母菌各试验菌株的回收率（n=2）

2.4 控制菌检查方法的适用性试验

取1∶10 磺胺嘧啶鱼肝油滴鼻剂供试液10 mL，及不大于100 cfu/mL的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌菌悬液1 mL，分别加至适宜体积、含适宜浓度对氨基苯甲酸的胰酪大豆胨液体培养基中，照《中国药典》2015年版四部（通则）1106项下控制菌检查方法进行检查，作为试验组。供试品对照组以稀释液代替菌液，阴性对照组以稀释液代替供试液和菌液，阳性对照组以稀释液代替供试液，乳化剂对照组以聚山梨酯-80 代替供试品，其余均同试验组操作；中和剂对照组以含适宜浓度对氨基苯甲酸的胰酪大豆胨液体培养基代替胰酪大豆胨液体培养基，其余同阳性对照组操作。该操作在C级背景下的A 级单向流空气区域内进行。

如表2 所示，磺胺嘧啶鱼肝油滴鼻剂的控制菌检查中铜绿假单胞菌采用直接接种法、培养基稀释法（200 mL）、中和法（0.5%对氨基苯甲酸，下同）可检出，大肠埃希菌采用培养基稀释法（400 mL）、中和法可检出，金黄色葡萄球菌采用中和法可检出。综合上述结果，控制菌检查采用中和法适用于磺胺嘧啶鱼肝油滴鼻剂的控制菌大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌检查，且乳化剂及中和剂对3种菌种均无毒性。

表2 控制菌检查的适用性试验结果

3 讨论

《中国药典》2015 年版规定，微生物限度检查应在不低于D 级背景下的B级单向流空气区域内进行，本试验在C 级背景下的A 级单向流空气区域内操作；鼻用制剂可接受的最大需氧菌总数为200 cfu/mL，最大霉菌和酵母菌总数为20 cfu/mL，即需氧菌、霉菌和酵母菌计数检查时供试品稀释级分别高于1∶200、1∶20 时无意义。本品为磺胺类药物，抗菌谱广，对大多数细菌如金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、大肠杆菌、芽孢杆菌等有良好的抗菌活性，试验中通过稀释供试品的方法无法消除其抑菌活性。当供试品因其抑菌活性无法选择最低稀释级的供试液进行方法适用性试验时，应采用适宜的方法对供试液进一步处理。如果供试品对微生物的抑制作用无法以其他方法消除，供试液可经过中和、稀释或薄膜过滤处理后再加入试验菌悬液进行方法适用性试验。前期试验证明，薄膜过滤法对于混悬剂适用性差，易造成薄膜堵塞。

本试验采用平皿法无法消除该药对需氧菌中枯草芽孢杆菌的抑菌作用，采用培养基稀释法可消除其抑菌活性，各菌株的回收率均符合规定。本品对真菌的抗菌活性较弱，结果证明，采用平皿法试验，白色念珠菌和黑曲霉的回收率范围在0.5～2.0，即进行霉菌和酵母菌计数检查时可采用平皿法进行适用性试验。本品对铜绿假单胞菌的抑制作用相对较弱，故控制菌检查采用直接接种法即可进行铜绿假单胞菌的适用性检查，但不适用于大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的检查。根据中国细菌耐药监测网数据，磺胺类药物对大肠埃希菌耐药率高于50%，而对金黄色葡萄球菌（包括甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌）耐药率低于20%，因此通过培养基稀释法，培养基体积增大到400 mL时可消除其对大肠埃希菌的抑制作用，但即使体积增加至1 000 mL 时，也无法消除其对金黄色葡萄球菌的抑制作用。磺胺类药物主要通过与对氨基苯甲酸竞争性结合二氢蝶酸合成酶，阻断细菌叶酸的合成而干扰细菌生长繁殖，这种抑菌作用可被对氨基苯甲酸逆转，且这种逆转作用呈现浓度依赖性。本研究对中和剂对氨基苯甲酸的浓度进行了筛选，将供试品接种至含0.5%对氨基苯甲酸的胰酪大豆胨液体培养基100 mL，可消除本品对控制菌金黄色葡萄球菌的抑制作用。经验证，此法同样适用于控制菌大肠埃希菌和铜绿假单胞菌的适用性检查。

因此，微生物计数检查中需氧菌计数采用培养基稀释法，霉菌及酵母菌采用平皿法；控制菌检查采用中和法，适用于磺胺嘧啶鱼肝油滴鼻剂微生物限度检查。本试验所建立的方法简单可行，结果准确有效，为其他磺胺类药物微生物限度检查方法的建立提供参考。