异柠檬酸脱氢酶1基因突变对替莫唑胺干预下脑胶质瘤U87细胞凋亡的影响

罗刚，喻坚柏，陈涛，唐宁，李春辉

胶质瘤年发病率约为0.06%，目前用于神经胶质瘤的常规疗法包括手术，放射和化学疗法。胶质母细胞瘤病人的总生存期仅为12～15个月，与肿瘤复发和整体预后不良有关，老年病人的预后更差。替莫唑胺是一种烷化剂，可在多个位置引起DNA 碱基甲基化，导致DNA 损伤和细胞凋亡。由于其在血脑屏障通透性方面的表现及其治疗效果，替莫唑胺已成为胶质瘤治疗的首选化疗药物。然而，抗辐射和替莫唑胺化疗是治疗恶性神经胶质瘤的一个日益严重的问题，极大地影响了这些病人的预后。2008年，超过70%的原发性胶质瘤和继发性胶质母细胞瘤中发现了异柠檬酸脱氢酶1/2（IDH1/2）的突变。IDH 突变的病人被认为比IDH 野生型（IDH1-WT）肿瘤的病人预后更好。特别是，IDH1 占 IDH 突变病例的最大比例，IDH1 中超过90%的突变被归类为R132H突变。Arg132的其他IDH1突变发生在较低频率，包括R132S和R132L。功能上，IDH1催化异柠檬酸转化为α-酮戊二酸（α-KG），并在细胞质和过氧化物酶体中产生尼古丁腺嘌呤二磷酸核苷酸（NADPH）。IDH1参与了许多细胞功能，包括葡萄糖感应，脂肪生成和细胞氧化还原状态的调节。本研究自2019年1—5月探究IDH1基因突变对替莫唑胺干预下脑胶质瘤U87 细胞凋亡的影响，以期深入了解其生物学特性及其化疗敏感性。

1 材料与方法

1.1 实验动物

60 只成年雄性健康SD 小鼠，体质量范围为150～200 g，购自湖南中医药大学实验动物中心。饲养室温度（22±2）°C，相对湿度（50±10）%，自由进食和饮水，所有实验动物均在相同条件下饲养，本研究符合一般动物实验伦理学原则。

1.2 裸鼠模型及实验分组

将60 只小鼠采用随机数字表法分成3 组：野生 IDH1 基因（wIDH1）组 20只，在裸鼠背部皮下注射wIDH1 胶质瘤细胞（5×10个细胞）；突变IDH1 基因（mIDH1）组20 只，在裸鼠背部皮下注射mIDH1 胶质瘤细胞（5×10个细胞）；对照组20只，在裸鼠背部皮下注射对照胶质瘤细胞（5×10个细胞）。

通过细胞注射处理雄性裸鼠并喂食14 d，根据小鼠的表面区域通过胃管饲法用替莫唑胺（75 mg/d）处理5 d。随后的观察期持续21 d。根据函数V（mm）=π（ab）/6 计算肿瘤大小（a 为宽，b 为长度）。根据函数S（m）=0.06×m（kg）2/3计算表面积。计算肿瘤形成率和总化疗效率。皮下荷瘤小鼠见图1。

图1 皮下荷瘤小鼠

1.3 细胞系和细胞培养

人恶性胶质母细胞瘤细胞系，U87 细胞和U251 细胞购自上海生物化学与细胞生物学研究所。将所有这些细胞系维持在高葡萄糖（Gibco，USA）的DMEM 培养基中，补充有10%胎牛血清（Gibco，USA），2 mmol/L 谷氨酰胺（Sigma，USA），抗生素（青霉素）100 U/mL 和链霉素100 μg/mL，在37°C的5%二氧化碳中。通过胰蛋白酶方法收集细胞。

1.4 载体和稳定细胞系的构建

wIDH1 或mIDH1的载体通过DNA 重组技术构建。携带wIDH1、mIDH1或空p-EGFP-C1载体的U87细胞系基础上的稳定细胞系通过转染方法分别构建，并通过G418方法最终选择。稳转细胞系的建立经验证实验（应用WB 检测 wIDH1、mIDH1 的表达）确定，筛选成功表达wIDH1或mIDH1蛋白的细胞系。

1.5 细胞增殖和活力测定

为了检测三种细胞系的增殖能力，使用胰蛋白酶消化和细胞计数方法。将相同数量的细胞在常规条件下培养48 h，然后通过胰蛋白酶方法收集并在细胞计数板上计数。通过最终细胞数与初始细胞数的比率计算增殖率。增殖抑制率的检测基于CCK-8 方法。将细胞以2×10个细胞/ 毫升（100 微克/孔）的密度接种在96 孔板中，使其生长48 h，使零剂量细胞生长48 h，作为相应的对照组。在实验结束时，向培养基中加入10 μL CCK-8 液体，将细胞培养 4 h。在 450 nm 处测量吸光度。细胞的增殖抑制率通过（1―Acontrol/A 替莫唑胺）×100%来评估。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡

流式细胞术用于评估细胞凋亡。用400 μmol/L 替莫唑胺处理细胞72 h。将未经替莫唑胺处理的细胞作对照组。然后，收集细胞并用膜联蛋白V-FITC 凋亡检测试剂盒（Keygen Biotech）处理。将细胞用PBS洗涤3次并重悬于400 μL 结合缓冲液中，然后在室温下在黑暗中与 5 μL 膜联蛋白 V-FITC 和 5 μL PI 一起温育 15 min。最后，使用流式细胞术（Gallios，Beckman-coulter，USA）在1 h内检测细胞凋亡。

1.7 Transwell 细胞侵袭实验

实验步骤：①基质胶准备：将冻存于-80°C冰箱的BD matrigel 4°C过夜，变成液态；②取300 μL 无血清培养基，加入60 μL 每室Matrigel ，混匀，4 ℃操作；放入37 ℃培养箱中，孵育5 h。③消化细胞，无血清培养基洗3 次，计数，配成细胞悬液；④用无血清培养基洗 Matrigel洗1次；每孔加入100 μL细胞悬液；⑤下腔室中加入500 μL含有20%FBS条件培养基；⑥37 ℃培养箱中，孵育24 h；⑦取出transwell 用PBS 洗2 遍，5%戊二醛固定，4 ℃；⑧结晶紫（0.1%）染色，室温0.5 h，PBS洗2遍，用棉球擦去上表面细胞，显微镜下观察。

1.8 蛋白质印迹分析

将细胞在冰冷的RIPA 裂解缓冲液中裂解。根据制造商的方案使用Bio-Rad 蛋白质测定法估计蛋白质浓度。通过SDS-PAGE 分离细胞裂解物并转移到PVDF膜上。将印迹在含有5%脱脂奶粉的TBS缓冲液中在室温下封闭1 h。将膜在4 ℃下与第一抗体一起温育过夜。洗涤膜并与辣根过氧化物酶缀合的第二抗体在室温下孵育1 h，洗涤。在每次用抗体处理后，用含有Tween20的tris缓冲盐水充分洗涤膜。根据制造商的说明，通过增强的化学发光进行抗体结合的检测。使用发光图像分析仪进行数据收集和处理。剥离相同的印迹并用抗β-肌动蛋白或抗GAPDH重新探测以用作内部对照。

1.9 酶联免疫吸附测定（ELISA）检测细胞凋亡蛋白的表达

采用ELISA 法将样本加入预冷的PBS（临用前加入蛋白酶抑制剂）匀浆，匀浆时置于冰上或冰浴中。吸取匀浆液到离心管，4 ℃、5 000×

g

离心5～10 min，取上清，-20 ℃或-80 ℃保存，避免反复冻融。按照说明书中操作步骤对三组半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）、B 淋巴细胞瘤-2 相关蛋白（Bax）表达水平进行测定。

2 结果

2.1 mIDH1 显著增加对替莫唑胺的化学敏感性

在细胞集落形成测定中，wIDH1 组、对照组和mIDH1 组之间细胞增殖差异无统计学意义（

P

＞0.05）。将 wIDH1 组、对照组和 mIDH1 组细胞暴露于替莫唑胺72 h，以评估其化学敏感性。结果显示，mIDH1 组U87 细胞在CCK-8 测定中显示出对替莫唑胺的敏感性，mIDH1 组细胞增殖和细胞活力较wIDH1组和对照组低，差异有统计学意义（

P

＜0.05）。见表1。

表1 细胞活力测定/

2.2 流式细胞术检测细胞凋亡

流式细胞术检测400 μmol/L 替莫唑胺处理后mIDH1 组与其他组细胞凋亡的差异，结果表明mIDH1 组细胞凋亡率（62.18±3.47）%高于对照组（33.16±6.54）%和wIDH1组（15.36±2.33）%，表明IDH1 R132H 突变增加对替莫唑胺的化学敏感性（

F=

11.147，

P=

0.003）。

2.3 细胞侵袭实验

mIDH1 组细胞侵袭能力低于对照组和wIDH1 组，三组中wIDH1 组细胞侵袭能力最强。表明IDH1 R132H 突变增加对替莫唑胺的化学敏感性。见图2。

图2 细胞侵袭实验（HE×100）：A为野生IDH1基因（wIDH1）组；B为对照组；C为突变IDH1基因（mIDH1）组

2.4 细胞凋亡蛋白的表达变化

为了研究mIDH1，wIDH1 和替莫唑胺诱导的细胞凋亡的潜在机制，应用蛋白质免疫印迹分析相关分子的蛋白质变化。结果显示，三组不同处理中，mIDH1 组在Caspase-3，Caspase-9 和 Bax 中的蛋白表达水平最高，Bcl-2 的蛋白表达水平最低（

P

＜0.05），wIDH1 的异位过表达显示出化疗抗性特征或至少诱导Bcl-2 蛋白表达水平的上调和 Caspase-3，Caspase-9 和 Bax 蛋白水平的下调。表明wIDH1 可能在化疗耐药中起辅助作用。mIDH1 通过下调Bcl-2 水平和上调体内和体外Caspase-3，Caspase-9 和Bax 水平来增强对胶质瘤细胞的化疗敏感性，表明mIDH1 可能作为化疗增强靶标起作用。见图3，表2。

图3 蛋白质免疫印迹

表2 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白（Bax）和B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）的蛋白表达水平/

2.5 ELISA 检测细胞凋亡蛋白的表达

mIDH1 组在三组中Caspase-3，Caspase-9 和Bax 中的表达水平最高，Bcl-2 的表达水平最低（

P

＜0.05），wIDH1 的异位过表达诱导Caspase-3，Caspase-9 和Bax 水平的下调以及Bcl-2表达水平的上调（

P

＜0.05）。见表3。

表3 酶联免疫吸附测定检测细胞凋亡蛋白的表达/

2.6 mIDH1 增强体内替莫唑胺抗肿瘤功效

所有注射接受的小鼠最终形成胶质瘤模型，用替莫唑胺处理，每个神经胶质瘤肿块的大小在第21天结束时测量，发现增殖结果与体外相似。mIDH1 肿瘤生长比wIDH1 组和对照组慢得多。与其余两组相比，mIDH1 组的肿瘤体积（220.17±12.15）mm最小（

P

＜0.05）。 wIDH1 组（624.36±33.54）mm与 对 照 组（601.17±36.18）mm差异无统计学意义（

P

＞0.05）。

2.7 mIDH1 提高替莫唑胺干预敏感性

体内研究显示，同时注射胶质瘤细胞和替莫唑胺胃管灌注处理裸鼠时，wIDH1 组肿瘤形成抑制率最低（41.37±5.43）%，mIDH1 组肿瘤形成抑制率最高（82.14±5.38）%，对照组为（52.16±3.17）%。在替莫唑胺治疗组中，mIDH1组总有效率为（73.15±8.46）%，wIDH1组总有效率为（22.16±3.96）%。对照组为（42.25±3.17）%。结果表明，wIDH1的过表达可能在体内提供化疗耐药性，而mIDH1可能提高化疗敏感性。

3 讨论

恶性胶质瘤目前与预后不良相关，尽管采用多模式治疗策略，复发仍然几乎不可避免。胶质瘤在组织学上分级为Ⅰ～Ⅳ，70%～90%的Ⅱ～Ⅲ级胶质瘤和继发性Ⅳ级胶质母细胞瘤在一个IDH1 等位基因中含有突变，其中 R132H 是最常见的。IDH1 存在于细胞质和过氧化物酶体中，在那里它将异柠檬酸转化为α-KG。然而，突变酶将α-KG 转化为代谢物D-2-羟基戊二酸，其结构类似于α-KG 和α-KG 依赖性双加氧酶的竞争性抑制剂。治疗胶质瘤通常包括手术切除，放射治疗和使用DNA 烷化剂替莫唑胺的化疗。替莫唑胺的细胞毒性作用主要通过产生 O-6-甲基鸟嘌呤（O6meG）病变来介导。如果甲基不被O6meG-DNA 甲基转移酶（MGMT）除去，这是一种与替莫唑胺抗性相关的酶，O6meG 在DNA 复制过程中与胸腺嘧啶错配，导致无效的错配修复和持续的G2 检查点停滞，随后细胞凋亡或衰老。MGMT启动子甲基化和因此低MGMT表达在IDH1 突变体胶质瘤中是典型的，但不是唯一的，其通常对替莫唑胺的反应优于它们的IDH1 野生型对应物。然而，MGMT 表达不是替莫唑胺敏感性的唯一决定因素，IDH1突变体和野生型胶质瘤具有不同的分子个体发育，使得IDH1 突变体和野生型胶质瘤之间的比较没有信息，哪些肿瘤特征可以直接归因于IDH1 突变。缺乏IDH1 突变的Ⅱ～Ⅲ级神经胶质瘤在遗传上与IDH1 突变神经胶质瘤不同，并且与原发性Ⅳ级胶质母细胞瘤更相似。虽然遗传改变如EGFR扩增和CDKN2A缺失在IDH1 WT胶质瘤中很常见，但它们很少发生在具有突变IDH1的胶质瘤中。尽管被认为化学反应性IDH1 突变胶质瘤通常在手术切除和放射治疗和替莫唑胺治疗后仍然复发，但突出了对新治疗方案的需求。

本研究发现mIDH1 在生物学行为和化疗敏感性方面表现出不同。本研究证明mIDH1 引起增殖抑制并上调化疗敏感性，其增强了替莫唑胺引起的细胞增殖和细胞凋亡的抑制作用。wIDH1 过表达不促进细胞增殖，但在替莫唑胺诱导的凋亡抑制中表现出化疗耐药特征。由于这些差异，胶质瘤可分为两种亚型，这两种亚型存在明显不同的预后。重要的是要了解这些差异并探索由mIDH1 诱导的相对更好的预后的机制。笔者认为肿瘤病人的预后取决于肿瘤细胞本身以及对其进行的治疗。前者涉及多因素事件，包括细胞周期、细胞凋亡等。细胞凋亡是程序性细胞死亡过程，其可由一些内源性或外源性因子诱导，即死亡信号诱导的死亡受体介导的途径和线粒体依赖性途径。细胞凋亡对于维持细胞数量的稳态非常重要。Caspase-cascade在细胞凋亡中至关重要。Bax/Bcl-2 的比例通常决定细胞凋亡和激活的半胱天冬酶级联反应。mIDH1和wIDH1 过度表达在常规条件下不会引起细胞凋亡，wIDH1 过表达抑制替莫唑胺诱导的细胞凋亡，其是通过降低Bax/ Bcl-2 比率和Caspase-3 活性。故而，mIDH1 异位表达通过增加Bax/ Bcl-2 比率和Caspase-3 活性来增强细胞凋亡。笔者推测，其机制与mIDH1下调胶质瘤细胞MMP-2、MMP-9体内外表达水平，从而降低肿瘤细胞侵袭能力有关。

综上所述，mIDH1 引起胶质瘤细胞的生物学变化，这减少了细胞的恶性行为。mIDH1 还在体内和体外增强胶质瘤细胞的化疗敏感性，而wIDH1 显示出化疗抗性特征。mIDH1 通过上调替莫唑胺后胶质瘤细胞 Caspase-3、Caspase-9、Bax 表达并下调Bcl-2表达提高胶质瘤细胞凋亡率，增强治疗敏感性。