姜黄素及其类似物H8对LPS诱导的单核巨噬细胞中炎症因子表达的影响

李 超，贾 茜，袁晓环，李 琳

(1.牡丹江医学院附属红旗医院；2.牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011)

姜黄素(curcumin)是一种低分子量化合物，具有抗氧化、抗炎、调节免疫、抗肿瘤、抗微生物等多方面药理作用[1-2]，并且它的毒性低，来源广泛，已成为医疗界的研究热点。但姜黄素在体内生物活性较低，代谢率高、生物利用率低，故在临床中限制了它的应用[3]。本实验前期通过姜黄素作为母体，去掉其β-二酮基团，设计出分子量更小、稳定性更高的姜黄素类似物H8[(2E,5E)-2,5-双亚苄基环戊酮](以下简称H8)。本研究拟探讨姜黄素及其类似物H8对炎症因子IL-6及TNF-α的影响，为炎症性疾病的治疗和研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 小鼠单核巨噬细胞株(j774a.1细胞)购自上海酶研科技有限公司。

1.1.2 药品与试剂 DMEM培养基、胎牛血清、青链霉素混合液、胰蛋白酶；CCK-8试剂盒(上海同仁化工DOJINDO)；逆转录试剂盒(上海优博公司)；Trizol试剂(北京博来公司)；PCR引物(ABI)；SYBR Green荧光染料(美国罗氏公司Roche)；LPS脂多糖(美国Sigma)；ELISA试剂盒(Mouse TNF-α ELISA kit、Mouse IL-6 ELISA kit 深圳欣博盛生物有限公司)；姜黄素(Sigma-Aldrich)；H8[(2E，5E)-2，5-双亚苄基环戊酮](本实验室合成)。

1.1.3 仪器 超净工作台(德国ESCO)；恒温细胞培养箱(美国Thermo Fisher)、相差显微镜(日本Olympus公司)；低温高速离心机(德国Eppendorf公司)；PCR仪(德国Eppendorf公司)；酶标仪(美国Bio-Rad公司)；分光光度计(美国Beckman公司)；高效液相色谱仪(美国 Aglient 1200)；荧光定量PCR仪(美国 ABI stepone)

1.2 方法

1.2.1 j774a.1细胞的培养 j774a.1单核巨噬细胞，为贴壁生长细胞，使用DMEM培养基培养[含10%胎牛血清及青霉素(100 U/mL)和链霉素(100 μg/mL)]，置37 ℃的恒温细胞培养箱中培养。细胞贴壁后更换培养液，当汇合度达到70%～80%时进行细胞传代。细胞传代贴壁后呈圆型，生长一定时间或当密度较高时呈梭型。

1.2.2 CCK-8法检测姜黄素及H8的细胞毒性 将j774a.1细胞以5000个/孔的数量接种于96孔板中，使用DMEM(含血清)完全培养基进行培育，待12 h细胞贴壁后经行换液。本实验分为对照组、药物处理组(浓度分别为1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L)，药物作用24 h后，在96孔版中加入10 μL /孔的CCK-8试剂，孵育5 h，使用酶标仪测定OD值，检测细胞存活率。重复本实验3次。

1.2.3 LPS诱导j774a.1细胞建立炎症细胞模型 用1 μg/mL的LPS作用于j774a.1细胞建立炎症细胞模型，实验分为6组：(1)对照组：使用PBS处理；(2)L组：1 μg/mL LPS处理；(3)LC1组：1 μg/mL LPS+10 μmol/L姜黄素；(4)LC2组：1 μg/mL LPS+20 μmol/L姜黄素；(5)LH1组：1 μg/mL LPS+10 μmol/L H8；(6)LH2组：1 μg/mL LPS+20 μmol/L H8。首先使用姜黄素或H8预处理细胞2 h，然后加入1 μg/mL LPS刺激22 h，分别收集培养基上清液和细胞进行ELISA和RT-qPCR检测。

1.2.4 RT-qPCR检测姜黄素及H8对炎症相关基因表达的影响 收集经过1.2.3步骤处理的细胞提取RNA，采用RT-qPCR技术检测各组细胞中炎症相关基因IL-6、TNF-α mRNA表达。各引物的序列如下：Mouse TNF-α 正向引物 5’-GCCACCACGCTCTTCTGTCT-3’，反向引物 5’-GGTCTGGGCCATAGAACTGATG-3’；Mouse IL-6正向引物 5’-ATGAAGTTCCTCTCTGCAAGAGACT-3’，反向引物 5’-CACTAGGTTTGCCGAGTAGATCTC-3’；Mouse Rps16正向引物 5’-AAGTCTTCGGGAGGCAAGAAA-3’，反向引物 5’-TTGCCCAGAAGCAGAACAG-3’。以Rps16基因为管家基因，通过Livak法计算IL-6和TNF-α mRNA表达含量。TNF-α扩增条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s；58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共25个循环，最后72 ℃延伸10 min。IL-6扩增条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s；58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min。重复试验3次。

1.2.5 酶联免疫吸附实验(ELISA) 按照1.2.3步骤处理的细胞，收集上清培养基于EP管中，1000 rmp离心5 min，将上清转移至新的EP管中备用，从4 ℃冰箱取出ELISA试剂盒平衡至室温，按试剂盒中说明书进行操作，每孔加入不同浓度的标准品或上清液(100 μL/孔)，反应终止后，用酶标仪测量其OD值，并计算出培养基中IL-6与TNF-α的含量，实验重复3次。

1.3 统计学处理采用GraphPad Prism 5.0软件进行统计学分析，数据以“均数±标准差”表示，使用One-way ANOVA对结果进行分析，以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 姜黄素及H8的细胞毒性比较姜黄素在浓度40 μmol/L时可见明显细胞存活率下降(P<0.001)，说明高浓度的姜黄素有一定的细胞毒性，其余浓度的药物与对照组相比，差异无统计学意义。故本实验采用低浓度姜黄素进行，见表1。

表1 不同浓度姜黄素及H8对细胞毒性检测结果

2.2 姜黄素及H8对炎症因子基因表达的影响与对照组相比，L组IL-6基因表达明显增加(P<0.01)；与L组相比，LC1组和LC2组IL-6基因表达明显降低(P<0.01)。与L组相比，LH1组、LH2组IL-6基因表达均显著下降(P<0.01)。并且发现与LC2组比较，LH2组IL-6基因有更显著的下降(P<0.01)。与对照组相比，L组TNF-α基因表达明显增加(P<0.01)；与L组相比，LC1组和LC2组TNF-α基因表达均著降低(P<0.01)。与L组相比，LH1组、LH2组TNF-α基因表达均显著下降(P<0.01)。并且与LC2组相比，LH2组TNF-α基因下降更明显(P<0.001)。以上结果表明H8对IL-6、TNF-α基因表达具有显著的抑制作用并且优于姜黄素，见表2。

表2 姜黄素和H8对LPS诱导的单核巨噬细胞TNF-α、IL-6基因表达的影响

2.3 姜黄素及其H8对炎症因子蛋白表达的影响与对照组相比，L组培养基上清中IL-6含量显增加(P<0.01)。与L组相比，LC1组、LC2组、LH1组、LH2组上清中IL-6表达均明显降低(P<0.01)。与LC2组相比LH2组上清中IL-6含量更明显降低(P<0.01)。与对照组相比，L组上清中TNF-α表达明显增加(P<0.01)；与L组相比，LC1组和LC2组TNF-α基因表达均著降低(P<0.001)。与L组相比，LH1组、LH2组TNF-α基因表达均显著下降(P<0.01)。并且与LC2组相比，LH2组TNF-α基因下降更明显(P<0.05)。以上结果证明了H8对LPS诱导的炎症模型IL-6、TNF-α蛋白表达具有显著的抑制作用并优于姜黄素，见表3。

表3 姜黄素和H8对LPS诱导的单核巨噬细胞TNF-α、IL-6蛋白表达的影响

3 讨论

炎症是机体对外界生物刺激所产生的一种生理性的防御反应，研究表明炎症的产生是许多慢性疾病如糖尿病、癌症、心血管疾病、关节炎、肥胖、自身免疫疾病等慢性疾病发生发展的主要原因，它参与在多种疾病的发生发展过程中。当致炎因子侵入机体时，体内的细胞如单核细胞、巨噬细胞等被激活，这些细胞会释放多种内源性的炎症介质，如前列腺素、白三烯、一氧化氮、组胺等，这些炎症介质会导致血管通透性增加，使炎症细胞趋化，进而导致炎症的发生[4]，所以寻找安全、有效的抗炎药物是医学界一直以来探寻的热点问题。

姜黄素具有低分子量的优点，并且具有抗肿瘤[5]、抗氧化[6]、抗炎[7]、调节免疫等多种生物学活性，其中抗炎作用这一优点尤为突显。但正是因为其在体内具有较低的生物活性、较高的代谢率[8]，较低的生物利用率[9]等原因使其结构中β二酮结构片段不稳定[10]。本实验室前期通过化学合成方法将姜黄素中的β二酮结构去掉，设计出H8，通过HPLC检测降解率发现姜黄素降解率大约是姜黄素类似物降解率的3倍，检测结果说明H8具有更强的稳定性，为进一步研发应用奠定了基础。

炎症反应的发生由多方面因素引起，其中细菌中脂多糖(LPS)为最常见的致炎因子，它可以剌激体内单核巨噬细胞合成和释放多种炎性介质如TNF-α、IL-6等，它们可以触发瀑布式炎症级联反应，进一步激活炎症细胞，诱导炎症反应的发生[11]。GUIMAR 等通过实验证明了姜黄素能够抑制脂多糖诱导的小鼠腹腔巨噬细胞炎症因子TNF-α和IL-6释放并呈剂量依赖性[6]。本实验以脂多糖(LPS)诱导小鼠单核巨噬细胞建立体外炎症模型，探究不同浓度的姜黄素及H8对炎性细胞因子在蛋白和基因中对TNF-α、IL-6表达的影响，结果发现在基因表达中：L组IL-6、TNF-α基因表达明显高于对照组。经过不同浓度姜黄素及H8干预后IL-6与TNF-α基因表达均降低，与LC2组相比LH2组降低更明显，表明H8在抑制炎症因子基因表达上优于姜黄素。炎症因子蛋白表达与基因表达结果相似，L组IL-6、TNF-α蛋白表达均高于对照组。姜黄素与H8均能抑制炎症相关蛋白表达，且与LC2组相比LH2组降低更明显。实验结果表明姜黄素及H8作用于炎症细胞模型后无论是在基因上还是在蛋白的表达上都能明显降低TNF-α和IL-6的表达，并且与相同浓度的姜黄素相比H8表现出更强的抗炎作用。

综上所述，姜黄素类似物H8不仅具有良好的稳定性，而且可以有效抑制炎性因子表达，发挥较强的抗炎作用，与姜黄素相比，其具有结构稳定、安全性高，抗炎效果好等优点，更可以有效的抑制炎症，可以更好指导临床，为临床提供新的用药方案。