新疆野生阿魏菇原生质体的再生与单核菌株交配型测定

努尔孜亚·亚力买买提，罗 影，郝敬喆，祁颢萱，裴龙英，孙春花,贾文捷，贾培松

(1. 新疆农业科学院植物保护研究所/农业部西北荒漠绿洲作物有害生物综合治理重点实验室，乌鲁木齐 830091；2. 新疆农业大学，乌鲁木齐 830091；3. 新疆理工学院，新疆阿克苏 843000；4.青河县农业技术推广中心，新疆阿勒泰 836200)

0 引 言

【研究意义】阿魏菇(Pleurotusferulae) 具有极高的食药用价值，是一种有良好市场前景的野生食用菌[1]。我国阿魏菇野生资源仅分布在新疆北疆地区的戈壁阿魏滩上，生长在阿魏属植物根茎部，分布量稀少[2-3]。近些年阿魏属植物分布面积极度萎缩[4-5]，以阿魏属植物为营养的野生阿魏菇，亟待保护[6-7]。目前，阿魏菇虽已大量栽培，但是由于国内人工栽培时间较久，商品阿魏菇存在种性不稳定、菌种退化等问题[8]，加强对阿魏菇新品种进行选育、种质资源的保护迫在眉睫。【前人研究进展】当前核心问题是怎样提纯复壮菌种[9]。优化培养基法、出菇组织再分离法是传统的菌种提纯复壮方式。其中，优化培养基法操作简单、耗费时间短，但效果不明显；出菇组织再分离法效果好，但周期长、过程复杂。然而原生质体单核化技术提纯复壮菌丝比上述方式效果更好。原生质体技术是现代农业生物技术的一个重要分支[10-11]，原慧等[12]研发出新疆野生阿魏菇(P.ferulae)的原生质体高效分离与再生工艺，所得阿魏菇原生质体恢复能力较强；樊晓琳等[13]通过该技术成功地对双孢蘑菇As2796实现复壮；谭琦等[14]将香菇野生种7号、栽培种Le l当做亲本，通过此项技术对申香8号展开选育；吴小平等[15]同样利用改技术获得了24个优良的灵芝菌种。江玉姬等[16]证实，原生质体单核化技术是对白色金针菇品种具改良作用的新工艺。交配型测定是控制菌种单孢杂交或单双杂交的交配、结实等关键遗传过程的决定步骤，2个异宗联合的菌株间交配因子的异同差异，是判别2个菌株亲缘关系远近和遗传距离的重要指标[10]。拮抗现象是反映菌株间遗传差异以及同缘关系的主要性状[17-18]，是物种之间为保持种群遗传物质稳定而限制外源基因侵入的本能反应，该现象在自然界普遍存在以防止不同个体间的融合[19]。【本研究切入点】虽然食用菌育种领域已普遍应用原生质体单核化技术，但是，目前应用原生质体单核化技术对新疆野生阿魏菇菌种进行提纯复壮还缺乏系统深入的研究。需研究利用原生质体单核化技术获得具有优良性状的阿魏菇(Pleurotusferulae)新菌种。【拟解决的关键问题】研究对原生质体技术获得的阿魏菇单核菌株进行交配型测定，分析阿魏菇原生质体单核菌株与亲本菌株在生长性状方面的差异，筛选阿魏菇杂交菌株并进行拮抗验证，获得性状优良的阿魏菇新菌种，为新疆野生阿魏菇新品种的选育及产业化奠定理论与技术基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试的3个亲本野生阿魏菇菌株PL001、PL176、PL163均由新疆农业科学院植物保护研究所食用菌实验室提供。

1.2 方 法

1.2.1 供试试剂与培养基

2%Lywallzyme(即溶壁酶，取自广东微生物研究所)：2%溶壁酶中加入0.6 M无菌甘露醇(mannitol)。

PDA 固体培养基：马铃薯 200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g；

PDA 液体培养基：马铃薯 200 g，葡萄糖15 g；

MYG 再生培养基：麦芽糖 10 g，葡萄糖4 g，酵母膏4 g，0.6 M甘露醇，琼脂粉20 g。。

以上培养基皆用水定容到1 000 mL，酸碱度自然，于121℃下，行20 min灭菌处理，再待用。

1.2.2 原生质体制备与再生

将供试菌株分别接种至PDA培养基平板纯化，生长7 d后挑取5×5 (mm)菌块接种至PDA培养基中央，在25℃、暗环境中，实施7 d培养。将新生菌丝挑至PDA液体培养基内，25℃静止培养 7 d，待出现菌丝球后利用筛网过滤菌丝，分别用无菌水、0.6 M甘露醇各冲洗1次，用滤纸吸干水分，放入10 mL离心管中，添加0.6 M甘露醇3 mL，当温度为4℃，转速为3 000 r/min时，5 min离心处理，弃上清液，将沉淀物加入2%溶壁酶3 mL，30℃水浴1.5～4.5 h，间隔30 min轻轻摇动离心管，镜检菌丝破壁情况。待酶解停止，将菌丝体混合液移至无菌且配备棉塞的注射器，经过滤将断裂菌丝清理掉，在3 000 r/min速度下，对滤液实施10 min离心，吸取上清，同时将沉淀收集起来，通过0.6 M甘露醇稀释。借助移液枪将0.1 mL的原生质体稀释液均匀涂布在再生培养基内，于25℃下暗培养，得到原生质体再生菌落。

1.2.3 单核菌株获得

利用单孢分离方法[20]，在显微镜下挑选菌落小、生长缓慢的单菌落接种至PDA固体斜面培养基上，等到菌落长到1 cm，显微镜下观察是否存在锁状联合，无锁装联合则为单核菌株。

1.2.4 菌株交配型测定及单核菌株筛选

选取3株单核菌株为测试菌株，分别与其它单核菌株进行配对，接种于PDA平板上并于25℃避光培养。7 d后显微观察菌丝锁状联合有无，再根据交配反应结果进行分析。确定交配类型后，根据各个单核菌株的生长速度进行筛选，以每个交配型中生长速率最快的作为育种材料。

1.2.5 杂交菌株获得

将不同亲本菌株中筛选出的不同交配型的单核菌株进行两两配对，在PDA固体培养基上进行杂交。挑取有锁状联合的菌丝接种到 PDA平板上培养2～3 d，挑取新鲜的菌丝进行纯化，获得杂交菌株。

1.3 数据处理

应用Excel 2010、SPSS 19.0软件对数据进行处理和方差分析(AVNOA)。

2 结果与分析

2.1 酶解时间对原生质体产量的影响

研究表明，供试菌株PL001、PL163和PL176在酶解1.5 h时均开始释放原生质体，此时产生的原生质体较大，40×单视野中个数为(3.1～4.4)×105，数量较少；2.5 h之后，观察到体积较小的原生质体，此时单视野中原生质体个数为(5.9～11.6)×105，随着酶解时间的延长，原生质体释放量越来越大。当酶解3.5 h时，40×目镜单视野中原生质体个数为(10.8～20.6)×105，原生质体释放量达到最大。当酶解时间延长至4.5 h，原生质体的再生数量开始降低，40×单视野中原生质体个数为(2.9～10.3)×105，随着酶解时间的延长，原生质体释放量越来越低。阿魏菇菌丝释放原生质体数量随时间延长呈先升高后降低的趋势，阿魏菇原生质体的酶解最佳时间为3.5 h。图1

图1 阿魏菇菌株释放出原生质体Fig.1 The protoplasts released by Pleurotus ferulae

2.2 原生质体再生与单核菌株获得情况

研究表明，获得了462个原生质体萌发单菌落，获得单核菌株50个。从 PL01菌株原生质体中分离获得156株单个原生质体再生菌株，其中20株无锁状联合，原生质体单核化率为12.8%；从 PL163菌株原质体中分离获得74 株单个原生质体再生菌株，其中20株无锁状联合，原生质体单核化率为27.02% ；从PL176 菌株原生质体中分离获得175株单个原生质体再生菌株，其中13株无锁状联合，原生质体单核化率为12.03%。表1

表1 原生质体单核菌株的数量以及单核获得比例Table1 The quantity of monocytic strains and the rate of monokaryogenesis

2.3 单核菌株交配型确定及单核菌株筛选

研究表明，在所得2类交配型单核菌株的占比方面，同一亲本菌株存在区别，PL01、PL163这2个亲本菌株的2类交配型的占比皆是1∶3， PL176此亲本菌株的2类交配型占比是1∶4。表2

表2 交配型分类结果Table 2 The classification of mating type

图2 原生质体产量随不同酶解时间的变化 (个 /mL)
Fig.2 The production of Ganoderma lucidum protoplast in different time(ind /mL)

不同交配型单核菌株的菌落形态及生长速度差异大，亲本菌株生长速度快于单核菌株，亲本PL01、PL163和PL176日长速分别为5.28、6.20和5.99 cm。在长速上，不同单核菌株之间的生长速度差异较大，根据单核菌丝的生长速度，每种交配型选择单核菌株 PL01-P16、PL01-P49、PL163-7、PL163-24、PL176-23、PL176-39作为杂交育种材料。表3，图4

注：A：单核菌丝；B：双核菌丝，可见锁状联合

图4 亲本菌株与单核菌株菌落形态Fig.4 Colony morphology of parent strain and monocyte strain

表3 亲本菌株与单核菌株的生长速度Table 3 The growth speed of mononuclear strains

2.4 杂交菌株的获得与验证

研究表明，共得到12株杂交菌株。在杂交菌株与亲本菌株之间出现明显的隆起拮抗带，拮抗带是不同菌株生长对抗的典型现象，纯化后获得的杂交菌株与亲本菌株是不同的菌株个体。表4，图5

表4 杂交菌株编号Table 4 hybrid strain

图5 亲本菌株与杂交菌株的拮抗实验Fig.5 Antagonism test between parental strain and hybrid strain

3 讨 论

目前利用原生质体单核化技术对新疆野生阿魏菇菌种进行提纯复壮研究较为缺乏。制备原生质体的关键是有效去除细胞壁。然而，由于溶壁酶浓度、酶解时间、水浴温度等诸多因素都会影响原生质体制备效率。酶解时间过短，生成的原生质体数量少但体积大；酶解时间过长，则原生质体的再生能力减弱。原慧等[12]研发新疆阿魏菇，35℃条件下酶解3 h，获得原生质体数量最多，原生质体再生能力随酶解时间的缩短而增强，但是原生质体细胞壁也随着酶解时间的长短而受到不同程度的降解，因此，确定合适的酶解时间十分关键。研究发现，3株野生阿魏菇在酶解3.5 h时，原生质体释放量最大，浓度达20.6×105个/ mL，因此，可将阿魏菇原生质体酶解时间控制在3.5 h。

野生阿魏菇菌龄的培养时间关系到原生质体获得率高低，培养时间短原生质体释放少，培养时间长则菌丝细胞壁难以充分酶解。不同菌类的最佳培养时间不同[8]，白灵菇最佳培养时间为4～7 d[7]，原慧等[12]阿魏菇菌丝选择最佳培养时间均为8 d，阿魏菇菌丝最佳培养时间为5～7 d。3株野生阿魏菇菌株共获得50个单核菌株。其中亲本菌株P L163、PL01和PL176原生质体单核化得率分别为25.68%、12.8%和10.8%，获得率较低，不同菌株获得原生质体单核化率有着明显差异，可能与原生质体制备时酶解时间不同有关。

研究3株野生阿魏菇菌株获得2种交配型单核菌株非等比例分配，可能是由2种交配型的再生率不同导致[21]。研究表明，不同单核菌株的生命力强弱、细胞质对核的选择作用以及某些与交配型基因连锁的致死效应因子也同时影响着交配型单核菌株的分配比例[22]，获得更多样本量的单核体以及控制好挑取时间可提高获得2种交配型单核菌株的数量[23]。原生质体是遗传转化的广泛受体之一，是多种植物的基因改造中都被作为接受外源基因的良好受体。原生质体单核化方法在研究细胞融合、突变与筛选等方面的应用普遍，利用原生质体单核化技术进行基因修饰已成为食用菌育种的有效途径之一[24]。

4 结 论

3株野生阿魏菇在酶解3.5 h时原生质体释放量最大，共获得50个再生单核菌株。亲本菌株PL163、PL01、PL176原生质体单核化率分别为 25.68%、12.8%、10.8%，3株阿魏菇菌株的原生质体再生能力在相同酶解条件下存在差异，获得率普遍较低。每个亲本菌株与单核菌株在菌丝长速、菌落形态方面均具有明显差异，但无一致规律。3株亲本阿魏菇原生质体单核菌株均获得2种交配型，但获得比例不同。3株阿魏菇野生菌株在原生质体再生单核获得率、长速、形态等方面具有丰富的多样性，获得杂交菌株。