LC-MS/MS 用于头孢拉定胶囊强制降解产物的结构分析

黄道明，郑露盼，张继红

上饶市食品药品检验检测中心，江西 上饶 334000

头孢拉定是第一代半合成头孢菌素，结构式见图1。其合成方法以化学合成法为主：即以7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸（7-ADCA）经成盐或酯化后，与经保护后的双氢苯甘氨酸中间体缩合，再水解、结晶得到头孢拉定［1］。随着对药品杂质特性的深入研究，依据杂质的药理特性,逐一制定每一个杂质限度的“杂质谱控制理念”已经被国内外普遍接受［2-5］。本研究前期采用了HPLC 法测定头孢拉定胶囊强制降解产物，明确了头孢拉定胶囊粉末在酸、碱及氧化条件下均有明显的降解产物生成［6］。而本次研究根据杂质谱控制理念，运用强制降解试验，进一步对头孢拉定胶囊强降解产物的结构及来源进行推测，为头孢拉定制剂稳定性研究提供重要依据，为药品生产、运输及贮存条件提供重要参考［7-11］。

图1 头孢拉定化学结构

1 仪器与试药

1.1 仪器

WatersTQ-S 液相质谱仪（美国沃特世），电子天平（Sartorius 公司），恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司），pH 计（Thermo 公司）。

1.2 试剂试药

头孢拉定胶囊（A 企业，批号：200310，250 mg/粒）；头孢拉定对照品（中国食品药品检定研究院，批号：130427-201107，含量88.3%），头孢氨苄对照品（中国食品药品检定研究院，批号：130408-201411，含量94.4%）；乙腈、甲醇为质谱纯（德国EMD Millipore 公司），甲酸（Formic Acid），水（市售屈臣氏饮用水）。

2 方法

2.1 色谱条件

采用SuperLu C18（100 mm×2.1 mm,1.8 μm）色谱柱，以0.2%甲酸溶液-乙腈（90∶10）为流动相，流速为0.3 mL/min,柱温为30 ℃,进样量为5 µL。

2.2 质谱条件

电子喷雾离子源（ESI）正离子模式，喷雾电压4 500 V；锥孔电压20 V；离子源电压50 V；离子源温度150 ℃；雾化气压力7.00 bar；锥孔气流量150 L/Hr；喷雾气流量1 000 L/Hr；碰撞能量10～40 eV；采用全扫描模式，扫描质量数范围50～500 m/z。

2.3 样品制备

2.3.1 供试品溶液的制备精密称取头孢拉定胶囊内容物25 mg，置于25 mL 容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.3.2 对照品溶液的制备精密称取头孢拉定对照10.25 mg，置100 mL 量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.3.3 强制降解试验溶液的制备强制降解条件如下：酸破坏（1 mol/L HCl 1 mL，50 ℃水浴，1 h）；碱破坏（0.05 mol/L NaOH 1 mL，50 ℃水浴，3 h）；氧化破坏（0.5% H2O21 mL，室温，1 h）。酸破坏和碱破坏在终止破坏前用相应浓度的NaOH 溶液和HCl 溶液中和，所有破坏样品最终用水稀释成含头孢拉定约1 mg/mL 的强制降解试验溶液。

2.4 结果

2.4.1 强制降解试验结果强制降解试验结果表明：在酸、碱和氧化试验均产生相应杂质，三种条件下杂质种类和数量有区别，尤其是在氧化试验条件和碱强制降解条件下区别明显，酸强制降解条件下产生的杂质与氧化试验条件下产生的杂质相似。随着强制降解条件的加强，杂质的离子流丰度越来越强。在供试品中除主峰外还检出了杂质12 头孢氨苄和相对保留时间为1.67 的杂质11，质荷比352 m/z 推测为4'-5'-二氢头孢拉定，且该杂质峰在碱强制降解条件下容易被降解。

图2 总离子流图（50～500m/z）：a 氧化试验；

2.4.2 杂质结构的分析首先根据一级质谱扫描得到各杂质的母离子，确定其相对分子质量和元素信息，再根据二级质谱获得碎片信息，结合化合物的一般裂解规律，推测其可能的化学结构。

杂质1 相对保留时间为0.1，氧化试验产生，一级质谱图中［M+H］+离子峰为416 m/z，与［C16H21N3O8S］+离子式相对应，二级质谱扫描的离子碎片峰399、273、158、140 m/z 等，均可由此结构经合理裂解产生。推测裂解过程及二级质谱图见图3。

图3 416 m/z结构裂解过程图（a）和二级质谱图（b）

表1 强降解产物的LC-MS/MS信息

杂质2 和杂质3 相对保留时间分别为0.12 和0.16，在酸降解，氧化试验中均有产生，其质谱图基本相同，［M+H］+离子峰为366.24 m/z，［M+Na］+离子峰为离子388.11 m/z，与［C16H19N3O5S］+离子式相对应。子离子峰348 m/z，为［M+H］+离子脱去一分子H2O 后形成的碎片离子，说明结构中含有裸露的羟基。子离子峰322 m/z 与［M+H］+离子相差44，推测为［M+H］+离子脱去一个羧基，说明结构中含有羧基，综上所述，见图4a（为《欧洲药典》杂质C 和D 异构体）和图4b，质谱图见图4c。

图4 杂质2和3的结构图（a、b；368 m/z）和质谱图（c）

杂质4、杂质5 和杂质6 相对保留时间分别为0.33、0.39 和1.11，在酸、碱降解和氧化试验中均有产生。其［M+H］+离子峰均为368 m/z，质谱图相似，与［C16H21N3O5S］+离子式相对应，可能为同分异构体。有文献报道［1］推测为β-内酰胺环上的酰胺键断裂，被氧化水解形成羧基。在氧化试验中还产生了杂质7 相对保留时间为0.2，其［M+H］+离子峰也为368 m/z，其离子碎片与杂质4、5 和6 的子离子碎片相似，但有一定差别，其结构有待进一步考察，结构见图5。

图5 368 m/z结构图

杂质8 相对保留时间为0.58，在氧化试验中产生。在质谱图中存在340 m/z 和363 m/z 的离子峰，分别推测为［M+H］+和［M+Na］+峰，即杂质8相对分子质量为339。其二级质谱子离子碎片189、122、322、278、305 m/z，均可由此结构经合理裂解产生。推测裂解过程及质谱图，见图6 和图7。

图6 杂质8裂解过程图

图7 杂质8质谱图

杂质9 和杂质10 相对保留时间分别为0.26和0.45，均在碱降解试验中产生。杂质9 质谱图中［M+H］+离子峰为177m/z，子离子峰149m/z为［M+H］+脱去一个羰基［4］，质谱图及结构推测如图8。杂质10［M+H］+离子峰为220 m/z，其结构有待进一步考察。

图8 杂质9和10的质谱图（a,b）及杂质9（c）结构推测

3 讨论

3.1 色谱条件选择与优化

据报道，对本品进行杂质检查时大多采用磷酸盐缓冲液作为流动相，不适合电喷雾离子化的质谱分析。本研究建立了适合头孢拉定LC-MS/MS 分析的色谱条件，并对其进行了优化。通过对甲醇:水、甲醇：0.1%甲酸水、乙腈：水、乙腈：0.05%甲酸水、乙腈：0.1%甲酸水、乙腈：0.2%甲酸水、乙腈:醋酸铵缓冲溶液和甲醇：醋酸铵缓冲溶液等8 种流动相系统，分别调节不同比例进行试验，结果表明在“2.1”项流动相条件下，头孢拉定峰保留时间适当，杂质有效分离，且峰型好，是较理想的流动相。

3.2 头孢拉定强降解杂质

本研究采用LC-MS/MS 分析法，检测出头孢拉定胶囊强制降解产物12 个，根据质谱分析和相关文献报道，其中可能包含了《欧洲药典》收载的杂质C 和杂质D，以及头孢氨苄和4'-5'-二氢头孢拉定等已知杂质。其余为未知杂质，其中m/z368 的杂质有4 个，有文献报道其1 种相关结构，针对这4 种杂质是同分异构体还是不同物质，有待进一步考察。其余的未知杂质结构未见相关文献报道。利用二级质谱进行结构解析，推测出其可能的结构，但结构的精准鉴定还有待借助多种手段进一步确证。